Virus DNA/RNA cDNA Synthesis Kit公司正在出售的產(chǎn)品：鮭魚胚胎細(xì)胞　磷化細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子SMAD2封閉多肽　河蟹顫抖病病毒PCR檢測(cè)試劑盒　大鼠上皮中性粒細(xì)胞活化肽78(ENA-78/CXCL5)ELISA Kit　尿氮活性比色法檢測(cè)試劑盒　快生芽孢桿菌　17號(hào)染色體開放閱讀框49抗體

商品屬性：

描述：本試劑盒采用穩(wěn)定高效的反轉(zhuǎn)錄預(yù)混體系 5×Golden RT MasterMix 進(jìn)行 RNA 的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使用時(shí)只需加入模 板、引物和 RNase Free H2O 即可，大大簡(jiǎn)化了操作過程、 提高了效率、減少了操作過程中的人為誤差。具有快速簡(jiǎn)便、 重復(fù)性高、特異性好、靈敏度高和穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。專用于 病毒 DNA/RNA 樣品的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。 該預(yù)混體系包含點(diǎn)突變致 RNase H 活性缺失的 Golden MLV Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、反應(yīng) Buffer 和 RNase Inhibitor。該試劑盒采用的反轉(zhuǎn)錄酶去除了 RNase H 活性，從而避免反轉(zhuǎn)錄過程中降解 RNA。同時(shí)經(jīng)過突變文 庫篩選，使得其熱穩(wěn)定性更強(qiáng)，可耐受 55℃高溫反應(yīng)。相比 于低溫條件下反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用高溫反轉(zhuǎn)錄可顯著打開 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而提高復(fù)雜 RNA 模板的擴(kuò)增性能、提高反轉(zhuǎn) 錄 cDNA 的長度和產(chǎn)量，從而提高后續(xù)檢測(cè)的靈敏度。合成 的第一鏈 cDNA 可廣泛用于 2nd Strand 的合成、雜交、PCR 擴(kuò)增、Real-Time PCR 反應(yīng)等。

組分

儲(chǔ)存：請(qǐng)置于-20°C，可保存 3 年；避免反復(fù)凍融。
注：如 5×Golden RT MasterMix 出現(xiàn)沉淀屬正?，F(xiàn)象，可用手捂化，混合均勻后使用不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。一步法 cDOn
1. 按以下組分配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液
病毒 DNA/RNA 樣品 2~10μl
5×Golden RT MasterMix 4μl
*20×Random Primer 1μl
Rnase Free H2O Up to 20μl
*注：反轉(zhuǎn)錄引物可根據(jù)需要改用特異性引物。
2.根據(jù)實(shí)際情況反轉(zhuǎn)錄可選擇快速程序或標(biāo)準(zhǔn)程序
快速程序
 37°C 15~30min（cDNA 合成）
 85°C 5min（失活 MLV）
標(biāo)準(zhǔn)程序
 25°C 10min（引物配對(duì)）
 55°C 30~60min（cDNA 合成）
 85°C 5min（失活 MLV）
注：通常在定量 PCR 實(shí)驗(yàn)中使用快速程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（反轉(zhuǎn)錄效率>80%），在進(jìn)行高 GC 含量、含復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)、長片段的模板轉(zhuǎn)錄時(shí)采用標(biāo)準(zhǔn)程序（反轉(zhuǎn)錄效率>100%）。

PCR基本步驟及注意事項(xiàng)？

一、實(shí)驗(yàn)原理

PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法，它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定位置的擴(kuò)增；PCR Buffer提供一個(gè)反應(yīng)的緩沖環(huán)境；反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣，DNA雙鏈打開，引物結(jié)合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復(fù)重復(fù)此過程即可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期(Plateau)會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物，cDNA等，但不能為RNA。對(duì)于不同類型的模板，其主要不同在于預(yù)變性的時(shí)間以及模板的量。一般對(duì)于大的基因組DNA預(yù)變性時(shí)間10min足夠，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結(jié)合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶，只能特意識(shí)別DNA鏈。

2.對(duì)于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對(duì)于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對(duì)PCR造成影響，故需對(duì)提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。對(duì)于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測(cè)結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2、PCR程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào),另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解?？赏ㄟ^PAGE電泳檢測(cè)引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對(duì)未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增)。

ct值過晚

在相對(duì)定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對(duì)定量中, 對(duì)低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會(huì)增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。

1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);

2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測(cè)或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋。

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