詳細(xì)介紹
商品屬性:
產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 貨號 |
9N (exo-) DNA Polymerase((2U/ul)) | 500U | A-PJ1044 |
描 述 :
末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)是一種不依賴于模板的 DNA 聚 合酶,催化脫氧核苷酸結(jié)合到 DNA 分子的 3’羥基端。帶有 突出、凹陷或平滑末端的單雙鏈 DNA 分子均可作為 TdT 的 底物,加尾長度可達(dá) 5~300nt。本酶經(jīng)電子重構(gòu)架技術(shù)篩選, 使其可以在 45°C 高溫下反應(yīng),從而避免因 DNA 二級結(jié)構(gòu)造 成的加尾效率下降。 該酶廣泛用于 DNA 的 3’末端添加同聚物、利用修飾堿 基(如 ddNTP,DIGdUTP)標(biāo)記 DNA 3’末端、TdT 介導(dǎo)的 dUTP 缺口末端標(biāo)記技術(shù)(細(xì)胞凋亡的原位檢測)等試驗。
活性定義:37 ℃ 60 分鐘內(nèi),催化 1nmol dNTP 加入到多聚核苷酸 3’羥基末端中所需的酶量定義為 1 個活性單位
熱失活:75°C 20min。
儲存:-20℃ 可保存 3 年。
注意事項
1、適量 EDTA 可使 Terminal Transferase 的活性喪失。
2、金屬離子螯合劑,較高濃度的銨根離子、氯離子、碘例子和磷酸根離子均對 Terminal Transferase 活性具有抑制作用。
3、DNA 末端 mol 數(shù)的計算,長度為 100bp 的 DNA:1pmol末端 DNA=0.33ng。
PCR基本步驟及注意事項?
一、實驗原理
PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法,它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計的特定序列,實現(xiàn)對特定位置的擴(kuò)增;PCR Buffer提供一個反應(yīng)的緩沖環(huán)境;反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣,DNA雙鏈打開,引物結(jié)合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結(jié)合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復(fù)重復(fù)此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。
在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應(yīng)。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增,達(dá)到較高水平。因此,應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù),在平臺期前結(jié)束反應(yīng), 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。
二、主要的成分
1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類型的模板,其主要不同在于預(yù)變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預(yù)變性時間10min足夠,質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。
注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結(jié)合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合,從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增,原因就在于實現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶,只能特意識別DNA鏈。
2.對于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,提取的濃度也往往比較大,為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴(kuò)增。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。
PCR實驗中應(yīng)該注意的問題有哪些?
沒有ct值
檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:
1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));
2、PCR程序設(shè)置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;
3、引物或探針降解??赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;
4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復(fù)凍融;
5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴(kuò)增)。
ct值過晚
在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。
因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設(shè)計和目的進(jìn)行。
1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計不合理, 需要重新設(shè)計;
2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);
3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;
4、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計超過500bp;
5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測或?qū)⒛0暹M(jìn)行稀釋。
公司正在出售的產(chǎn)品:
禽呼腸孤病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒 | 表達(dá)于SiSo細(xì)胞系的受體結(jié)合型腫瘤抗原ELISA試劑盒 RCAS1免費(fèi)代測試劑 | 白斑綜合癥病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒 |
梭狀桿菌PCR檢測試劑盒供應(yīng) | 大皰性類天皰瘡抗體ELISA試劑盒 BP免費(fèi)代測試劑 | 鳥分枝桿菌類結(jié)核亞型PCR檢測試劑盒直銷 |
豬水皰性口炎(VSV)核檢測試劑盒 | 細(xì)胞周期B2ELISA試劑盒 | 馬隱秘桿菌PCR檢測試劑盒 |
副豬嗜血桿菌定量PCR檢測試劑盒 | 單酰甘油-O-?;D(zhuǎn)移3ELISA試劑盒 | 曼那角病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒 |
馬流感病毒H3N8亞型染料法熒光定量RT-PCR試劑盒 | 蛋白水解誘導(dǎo)因子/皮離蛋白ELISA試劑盒 | 斑點(diǎn)叉尾鮰病毒探針法熒光定量PCR試劑盒 |
禽白血病病毒G亞群染料法熒光定量RT-PCR試劑盒 | 淀粉αELISA試劑盒 | 豬流感(SIV)核檢測試劑盒 |
禽傳染性支氣管炎病毒PCR檢測試劑盒 | 端粒重復(fù)序列結(jié)合因子1ELISA試劑盒 | 七星庫道蟲染料法熒光定量PCR試劑盒 |
馬流感病毒亞型PCR檢測試劑盒 | 多肽-N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移11ELISA試劑盒 | 淋病奈瑟菌PCR檢測試劑盒 |
馬立克氏病病毒1型探針法熒光定量PCR試劑盒 | 二甲基精氨二水解1ELISA試劑盒 | 牛皰疹病毒1型探針法熒光定量PCR試劑盒 |
禽白血病/肉瘤病毒PCR檢測試劑盒價格 | 芳基硫酯GELISA試劑盒 | 馬腺病毒探針法熒光定量PCR試劑盒 |
鯉皰疹病毒3型PCR檢測試劑盒供應(yīng) | 人二氫嘧啶脫氫[NADP+](DPYD)ELISA試劑盒 | 葡萄球菌屬通用PCR檢測試劑盒 |
諾卡菌核檢測試劑盒 | 人甘露糖受體(MR)ELISA檢測試劑盒 | 靈芝探針法PCR鑒定試劑盒 |
內(nèi)阿米巴通用染料法熒光定量PCR試劑盒 | 人程序性細(xì)胞死亡因子4(PDCD4)試劑盒ELISA | 斯氏普羅威登斯菌PCR檢測試劑盒 |
莫巴拉病毒PCR檢測試劑盒 | 人α干擾(IFN-α)ELISA檢測試劑盒 | 9N (exo-) DNA Polymerase((2U/ul))梭狀桿菌屬通用探針法熒光定量PCR試劑盒 |
野兔熱(Tul)核檢測試劑盒 | 人腸三葉因子(ITF)ELISA試劑盒 | 氣單胞菌通用探針法熒光定量PCR試劑盒 |