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          上海撫生實(shí)業(yè)有限公司>>PCR相關(guān)試劑>>PCR相關(guān)>>2XRAPA HiFi PCR Mix(with dye)

          2XRAPA HiFi PCR Mix(with dye)

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            上海市

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          更新時(shí)間:2024-01-12 14:51:42瀏覽次數(shù):703

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          產(chǎn)品簡(jiǎn)介

          供貨周期 現(xiàn)貨 規(guī)格 1ml、10ml
          貨號(hào) A-PJ1030 應(yīng)用領(lǐng)域 化工
          主要用途 僅供科研研究實(shí)驗(yàn)    
          2XRAPA HiFi PCR Mix(with dye)公司正在出售的產(chǎn)品:白血病耐藥株 Kelch樣蛋白26封閉多肽 牛病毒性腹瀉病毒通用PCR檢測(cè)試劑盒 大鼠因子IX(FIX)ELISA Kit 甲基檸檬合(MCS)活性比色法檢測(cè)試劑盒 塔斯曼尼亞弧菌 磷化Runx3抗體

          詳細(xì)介紹

          商品屬性:

          產(chǎn)品名稱

          規(guī)格

          貨號(hào)

          2XRAPA HiFi PCR Mix(with dye)

          1ml

          A-PJ1030

          2XRAPA HiFi PCR Mix(with dye)

          10ml

          A-PJ1030

          RAPA HiFi DNA 聚合酶,其來(lái)源于高保真 DNA 聚合 酶,并加入了增強(qiáng)的延伸結(jié)構(gòu),使其具有超保真性能(~280 倍 Taq)、長(zhǎng)片段擴(kuò)增能力、高產(chǎn)量。長(zhǎng)片段擴(kuò)增能力,使用 該酶可輕松擴(kuò)增 8kb 的基因組 DNA、20kb 的λ DNA、8kb 的 cDNA。該酶具有 6kb/min 以上的延伸速度。該 PCR Mix 具有 5’-3’的聚合酶活性、強(qiáng) 3’-5’的外切酶活性,產(chǎn)物為平末 端。該制品中已經(jīng)含有溴酚藍(lán)染料,PCR 擴(kuò)增完畢后可直接 點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠,無(wú)需再加入 DNA Loading Buffer。

          QQ截圖20240110094643.jpg特點(diǎn)和用途
          (1) 超保真擴(kuò)增:~280 倍 Taq 的保真性能,是載體構(gòu)建、點(diǎn)突變、NGS 模板擴(kuò)增、基因合成的最佳用酶。
          (2) 快速擴(kuò)增:具有 6kb/min 的擴(kuò)增能力。
          (3) 長(zhǎng)片段擴(kuò)增:質(zhì)粒、λDNA 等簡(jiǎn)單模板可以有效擴(kuò)增>20 kb,基因組可以有效擴(kuò)增>8 kb,cDNA 可以有效擴(kuò)增>8kb。
          儲(chǔ)存:長(zhǎng)期儲(chǔ)存置于-20°C 以下,可保存 2 年;短期使用置于 4°C(3 個(gè)月)保存。
          使用方法
          1. 按下表配制反應(yīng)體系并混合均勻:
          2×RAPA HiFi PCR Mix 12.5 μl
          上游引物(10 μM) 1 μl
          下游引物(10 μM) 1 μl
          模板 DNA 1-250 ng
          ddH2O up to 25 μl
          *模板 DNA 用量參數(shù)(25 μl 反應(yīng)體系)
          5-250 ng Genomic DNA
          0.1-10 ng Plasmid DNA
          1-2 μl cDNA from RT reaction
          2. PCR 擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)
          (1)擴(kuò)增片段<5kb 時(shí)采用如下程序
          循環(huán)數(shù) 溫度 時(shí)間
          1st Cycle 95°C 1min
          25-35 Cycles
          95°C 30s
          50~60°C 30s
          72°C 6kb/min
          Last Cycle 72°C 2min
          (2)擴(kuò)增片段>5kb 時(shí)采用如下程序
          循環(huán)數(shù) 溫度 時(shí)間
          1st Cycle 92°C 1min
          25-35 Cycles
          92°C 30s
          50~60°C 30s
          72°C 2-3kb/min
          Last Cycle 72°C 2min
          3. 電泳:1% 瓊脂糖凝膠電泳,上樣 5 μl,電泳結(jié)束在紫外燈下檢測(cè)條帶。
          4. 注意事項(xiàng):(1)當(dāng)模板 GC 含量>65%時(shí),請(qǐng)?zhí)砑?br style="box-sizing: border-box; margin: 0px;"/>5× Q-Solution(Cat. No.: A3002)。(2)當(dāng)擴(kuò)增片段<1kb>5kb 時(shí),按照2-3kb/min 的延伸時(shí)間進(jìn)行設(shè)置,能獲得更高的產(chǎn)量。(3)由于不同的 PCR 管其導(dǎo)熱性能有所不同,通常 PCR 采用25μl 體系可以獲得更高的產(chǎn)量。


          65.jpg

          67.jpg


          PCR基本步驟及注意事項(xiàng)?

          一、實(shí)驗(yàn)原理

          PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法,它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列,實(shí)現(xiàn)對(duì)特定位置的擴(kuò)增;PCR Buffer提供一個(gè)反應(yīng)的緩沖環(huán)境;反應(yīng)過(guò)程同生物體內(nèi)一樣,DNA雙鏈打開(kāi),引物結(jié)合模板,延伸形成新鏈。而這些過(guò)程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過(guò)控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開(kāi)雙鏈,在退火溫度處引物結(jié)合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復(fù)重復(fù)此過(guò)程即可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開(kāi)始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

          在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來(lái)呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期(Plateau)會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增,達(dá)到較高水平。因此,應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù),在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng), 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

          二、主要的成分

          1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物,cDNA等,但不能為RNA。對(duì)于不同類型的模板,其主要不同在于預(yù)變性的時(shí)間以及模板的量。一般對(duì)于大的基因組DNA預(yù)變性時(shí)間10min足夠,質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

          注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過(guò)在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結(jié)合,合成另一條鏈。從第二輪開(kāi)始,兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增,原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶,只能特意識(shí)別DNA鏈。

          2.對(duì)于模版的量來(lái)說(shuō),一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對(duì)于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,提取的濃度也往往比較大,為防止?jié)舛冗^(guò)大對(duì)PCR造成影響,故需對(duì)提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過(guò)高則可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。對(duì)于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,且提取濃度一般較低,則無(wú)需稀釋。

          PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問(wèn)題有哪些?

          沒(méi)有ct值

          檢測(cè)結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問(wèn)題:

          1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過(guò)45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

          2、PCR程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào),另外熒光采集是否選中;

          3、引物或探針降解。可通過(guò)PAGE電泳檢測(cè)引物和探針是否降解;

          4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過(guò)500ng,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)即可), 對(duì)未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融;

          5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過(guò)4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增)。

          ct值過(guò)晚

          在相對(duì)定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對(duì)定量中, 對(duì)低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會(huì)增大, 但是一般不宜超過(guò)40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。

          因此,判斷Ct值出現(xiàn)過(guò)晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。

          1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);

          2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長(zhǎng)10s);

          3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

          4、PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過(guò)500bp;

          5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測(cè)或?qū)⒛0暹M(jìn)行稀釋。

          公司正在出售的產(chǎn)品:

          黃曲霉染料法熒光定量PCR試劑盒

          丙型肝炎IgGELISA試劑盒 HCV-IgG免費(fèi)代測(cè)試劑

          沙眼衣原體染料法熒光定量PCR試劑盒

          溶血梭狀桿菌PCR檢測(cè)試劑盒價(jià)格

          促腎上腺皮質(zhì)激樣中葉肽ELISA試劑盒 CLIP免費(fèi)代測(cè)試劑

          乳桿菌屬通用PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

          豬痢疾蛇形螺旋體(SH)核檢測(cè)試劑盒

          皮膚T-淋巴細(xì)胞關(guān)聯(lián)抗原ELISA試劑盒

          貓杯狀病毒PCR檢測(cè)試劑盒

          肺炎支原體PCR檢測(cè)試劑盒

          單純皰疹病毒Ⅰ+ⅡELISA試劑盒

          貓傳染性腹膜炎病毒(貓傳腹病毒)探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒

          馬立克氏病病毒1型染料法熒光定量PCR試劑盒

          蛋白酪氨磷受體RELISA試劑盒

          刺激隱核蟲(chóng)探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒

          禽傳染性支氣管炎病毒Ark型探針?lè)晒舛?/span>RT-PCR試劑盒

          抵抗樣蛋白βELISA試劑盒

          口蹄疫病毒通用型(FMDV-U)核檢測(cè)試劑盒

          禽結(jié)核分枝桿菌探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒

          動(dòng)力蛋白軸絲重鏈11ELISA試劑盒

          葡萄糖苷曼氏桿菌探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒

          馬立克氏病病毒1型探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒

          多巴胺脫羧ELISA試劑盒

          流感病毒H3N2亞型PCR檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)

          馬蛔蟲(chóng)探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒

          耳蝶呤1ELISA試劑盒

          牛冠狀病毒探針?lè)晒舛?/span>RT-PCR試劑盒

          禽波氏桿菌探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒

          泛結(jié)合E2C結(jié)合蛋白E2L3ELISA試劑盒

          麥芽香肉桿菌PCR檢測(cè)試劑盒

          梨孢鐮刀菌PCR檢測(cè)試劑盒價(jià)格

          人肺特異性X蛋白(LUNX)ELISA試劑盒

          皮炎芽生菌PCR檢測(cè)試劑盒價(jià)格

          諾如病毒/ Ⅱ/ 輪狀病毒 A 組核檢測(cè)試劑盒 ( 三重?zé)晒?PCR )

          人黑瘤衍生亮氨拉鏈額外核因子(MLZE)ELISA檢測(cè)試劑盒

          三線鐮刀菌染料法熒光定量PCR試劑盒

          腦膜炎敗血伊麗莎白菌染料法熒光定量qPCR試劑盒

          人催乳(PRL)試劑盒ELISA

          無(wú)綠藻通用PCR檢測(cè)試劑盒

          小孢子菌屬通用探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒

          αL艾杜糖苷(IDUA) ELISA試劑盒

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          豬藍(lán)耳病病毒經(jīng)典型(PRRSV-C)核檢測(cè)試劑盒

          人不對(duì)稱二甲基精氨(A)ELISA檢測(cè)試劑盒

          普雷沃菌屬通用探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒

           


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