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          上海撫生實(shí)業(yè)有限公司>>PCR相關(guān)試劑>>核酸純化>>pBM29 Toposmart 克隆試劑盒

          pBM29 Toposmart 克隆試劑盒

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            上海市

          規(guī)格
          20 次 ×32808元15 盒 可售
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          更新時間:2024-01-12 13:13:22瀏覽次數(shù):669

          聯(lián)系我們時請說明是化工儀器網(wǎng)上看到的信息,謝謝!

          產(chǎn)品簡介

          供貨周期 現(xiàn)貨 規(guī)格 20 次 ×3
          貨號 A-Hc2214 應(yīng)用領(lǐng)域 化工
          主要用途 僅供科研研究實(shí)驗(yàn)    
          pBM29 Toposmart 克隆試劑盒公司正在出售的產(chǎn)品:人結(jié)直腸癌細(xì)胞Luciferase熒光穩(wěn)轉(zhuǎn)株 PTAR1蛋白封閉多肽 貝氏貝諾孢子蟲PCR檢測試劑盒 大鼠磷脂酰肌醇抗體IgG/IgM(PI Ab-IgG/IgM)ELISA Kit 甘油三酯(TG)含量活性比色法檢測試劑盒 鴨川火色桿菌 TRIM50蛋白抗體

          詳細(xì)介紹

          公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷!

          貨號

          產(chǎn)品名稱

          規(guī)格

          A-Hc2214

          pBM29 Toposmart 克隆試劑盒

          20 ×3

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          PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備?

          試劑:
          模板DNA:PCR反應(yīng)需要模板DNA,如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等;引物:PCR反應(yīng)的兩個引物,分別與模板DNA的兩端配對擴(kuò)增所需的特定區(qū)域,引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物;dNTPs:PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs,包括脫氧腺苷酸(dATP)、脫氧胸苷酸(dCTP)、脫氧鳥苷酸(dGTP)、脫氧胞嘧啶酸(dTTP),用于細(xì)胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過程,用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增;Taq DNA聚合酶:PCR反應(yīng)需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等,用于擴(kuò)增DNA鏈;PCR buffer溶液:對PCR反應(yīng)具有緩沖作用,調(diào)節(jié)反應(yīng)pH,硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛,可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性,從而提高反應(yīng)效率;酶切體系:PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實(shí)驗(yàn)步驟,常常需要進(jìn)行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn),用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒:用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物;
          設(shè)備:
          PCR儀:用于控制反應(yīng)溫度,保證PCR反應(yīng)時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制;電泳槽:用于分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;核酸提取儀:從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是,只有在有序齊全的基礎(chǔ)上,才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果。

          PCR相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn):

          PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個循環(huán)組成,每個循環(huán)包括以下3個步驟:

          一、變性:

          利用高溫(93-98℃)使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前,通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離,僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘,接下來PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。

          二、退火或稱接合,復(fù)性:

          在DNA雙鏈分離后,降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃。錯誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯誤地結(jié)合。該步驟時間1-2分鐘。

          三、延伸:

          DNA聚合酶由降溫時結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr(來自于嗜熱菌Thermus brockianus)約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

          PCR反應(yīng)條件優(yōu)化:

          1、變性溫度和時間:

          保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜WC整個PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s,再復(fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長,可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

          2、復(fù)性溫度和時間:

          PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高,產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低,產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。

          3、延伸溫度和時間:

          一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時,過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合,可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時間,可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定,小于1kb, 1min足夠;大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間。這里需要注意,延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時間。

          4、循環(huán)數(shù):

          其他參數(shù)選定后,PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后,PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值,實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%,因此不管模板濃度是多少,20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多,非特異擴(kuò)增增加。

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