詳細(xì)介紹
公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷!
貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
A-PJ1010 | Bst 4.0 SYBR Green Mix | 100Tx20μl |
該制品為單一組分的 MasterMix(2 倍濃度),包含了反應(yīng)緩沖液、SYBR Green 熒光染料、Mg2+、dNTP、Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶等,使用時(shí)只需要加入引物、模板即可進(jìn)行核酸恒溫?cái)U(kuò)增。Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶具有依賴于 RNA 模板的聚合酶活性(逆轉(zhuǎn)錄),還具有依賴于 DNA 的聚合酶活性,因此無論 DNA 或 RNA 樣本均可使用該制品進(jìn)行高效的恒溫?cái)U(kuò)增。該制品是進(jìn)行 LAMP及 RT-LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)的試劑。優(yōu)化的反應(yīng)體系,確??焖俚耐瓿蓹z測試劑的反應(yīng)體系建立。SYBR Green 系列產(chǎn)品為恒溫?zé)晒鈹U(kuò)增的專用試劑,可配套熒光定量 PCR 儀,或恒溫?zé)晒鈾z測儀使用。SYBRGreen 的激發(fā)波長為 480nm,檢測波長為 520nm。除此外,該制品還可以用于其它恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)驗(yàn),包括 CPA、SMAP 等。
儲(chǔ)存:長期保存制品于-20℃,保存 2 年。
使用實(shí)例(以 LAMP 恒溫?zé)晒鈹U(kuò)增為例):
1. 配制反應(yīng)體系
在 0.2ml EP 反應(yīng)管中加入下述試劑
2xBst4.0 SYBR Green Mix 10 μl
10xLAMP Primer Mix 2 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到總體積 20 μl
10xLAMP Primer Mix 濃度:FIP/BIP 分別為 16 μM、
2. 反應(yīng)體系配好后,置于熒光定量 PCR 儀中于60~68°C(實(shí)驗(yàn)采用 65°C)進(jìn)行反應(yīng) 20~45min。1min收集一次熒光信號(hào)。讀取擴(kuò)增曲線進(jìn)行陰性和陽性判讀。
注意事項(xiàng):
1. 在用于其它恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)時(shí)(如 CPA、SMAP 等),
2. 關(guān)于礦物油的使用,在配制完 LAMP 反應(yīng)體系后
PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備?
試劑:
模板DNA:PCR反應(yīng)需要模板DNA,如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等;引物:PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物,分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域,引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物;dNTPs:PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs,包括脫氧腺苷酸(dATP)、脫氧胸苷酸(dCTP)、脫氧鳥苷酸(dGTP)、脫氧胞嘧啶酸(dTTP),用于細(xì)胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過程,用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增;Taq DNA聚合酶:PCR反應(yīng)需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等,用于擴(kuò)增DNA鏈;PCR buffer溶液:對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用,調(diào)節(jié)反應(yīng)pH,硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛,可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性,從而提高反應(yīng)效率;酶切體系:PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實(shí)驗(yàn)步驟,常常需要進(jìn)行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn),用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒:用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物;
設(shè)備:
PCR儀:用于控制反應(yīng)溫度,保證PCR反應(yīng)時(shí)不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制;電泳槽:用于分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;核酸提取儀:從組織樣本中全自動(dòng)提取核酸。 這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是,只有在有序齊全的基礎(chǔ)上,才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果。
PCR相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn):
PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個(gè)循環(huán)組成,每個(gè)循環(huán)包括以下3個(gè)步驟:
一、變性:
利用高溫(93-98℃)使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個(gè)循環(huán)之前,通常加熱長一些時(shí)間以確保模板和引物分離,僅以單鏈形式存在。該步驟時(shí)間1-2分鐘,接下來PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。
二、退火或稱接合,復(fù)性:
在DNA雙鏈分離后,降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃。錯(cuò)誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯(cuò)誤地結(jié)合。該步驟時(shí)間1-2分鐘。
三、延伸:
DNA聚合酶由降溫時(shí)結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時(shí)間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計(jì)合成1000bp/min、較新的Tbr(來自于嗜熱菌Thermus brockianus)約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。
PCR反應(yīng)條件優(yōu)化:
1、變性溫度和時(shí)間:
保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜WC整個(gè)PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s,再復(fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時(shí)間過長,可對(duì)Taq酶活性和dNTP分子造成損害。
2、復(fù)性溫度和時(shí)間:
PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高,產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低,產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。
3、延伸溫度和時(shí)間:
一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個(gè)核苷酸時(shí),過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合,可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時(shí)間,可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定,小于1kb, 1min足夠;大于1kb需加長延伸時(shí)間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時(shí)間。這里需要注意,延伸時(shí)間過長可能出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時(shí)間。
4、循環(huán)數(shù):
其他參數(shù)選定后,PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后,PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值,實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%,因此不管模板濃度是多少,20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多,非特異擴(kuò)增增加。
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