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病毒RNA提取純化試劑的常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作
病毒RNA提取純化試劑是于血清(血漿)等液體樣品中提取病毒RNA的純化試劑。
實(shí)驗(yàn)操作：
1.如果有N個(gè)樣品，標(biāo)記N+2個(gè)1.5-2mL螺旋蓋塑料離心管，多出的一個(gè)為陽(yáng)性對(duì)照，一個(gè)為陰性對(duì)照。為避免污染，建議不要使用壓蓋式塑料離心管。在每個(gè)管上做個(gè)標(biāo)記，以在后續(xù)操作時(shí)區(qū)別向心面和離心面。
2.在離心管中分別加入0.2mL液體樣品（血清、血漿、尿液、腦脊液、唾液、眼淚等等），陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
如果是口腔拭子、咽喉拭子等各種拭子樣品，則將拭子放入0.2mL自備生理鹽水中擠壓出液體，然后取0.2mL進(jìn)行提取。
如果是糞便等半固定樣品，則取約0.3mL的樣品，加入0.3自備生理鹽水，震蕩重懸，離心取0.2mL上清進(jìn)行提取。
如果血液，細(xì)胞培養(yǎng)液等含細(xì)胞的液體，可以離心用上清，也可以直接取用，但后者提取的RNA中有細(xì)胞的基因組DNA污染。血漿的抗凝劑必須是EDTA或ACD，不能是肝素。使用ACD時(shí)由于所加入ACD會(huì)增加體積，樣品會(huì)被稀釋?zhuān)玫降牟《镜味葧?huì)比使用 EDTA低15%左右。血漿按0.6mL/管的量分裝保存，以避免反復(fù)凍融。
如果樣品是實(shí)體組織或培養(yǎng)細(xì)胞，則需要在自備生理鹽水中勻漿后離心，用0.2mL上清液（含病毒）進(jìn)行提取，但此種情況下后得到的RNA不可避免的會(huì)含有基因組DNA 污染。
如果液體樣品中的病毒需要富集，可以使用1.5mL上述方法得到的液體在4℃24000g 冷凍離心60分鐘，移棄1.3mL、用剩下的0.2mL繼續(xù)操作。
3.在每個(gè)離心管中加入0.6mL RNA病毒裂解液。RNA病毒裂解液在低溫放置會(huì)產(chǎn)生結(jié)晶沉淀，需提前65℃水浴溶解并充分搖勻后取用。
4.室溫放置10分鐘裂解病毒。
5.振蕩數(shù)秒后加入0.7mL室溫異丙醇，旋緊蓋后振蕩30秒混勻，把離心管的向心面對(duì)向轉(zhuǎn)頭的中央，13000-15000g室溫離心至少15分鐘。
6.小心移棄上清，注意不要觸及管底和管壁離心面的RNA沉淀（此時(shí)可能看不見(jiàn)）。
7.加入1.0mL室溫70%乙醇，振蕩數(shù)秒后15000g室溫離心5分鐘。注意：在離心機(jī)中放置離心管時(shí)將其向心面對(duì)向轉(zhuǎn)頭的中央。
8.小心移棄上清，注意不要觸及管底和管壁離心面的RNA沉淀（此時(shí)呈膜狀沉淀）。
9.再短暫離心數(shù)秒，用移液器移棄殘留液體（70%乙醇），否則它會(huì)影響后續(xù)反應(yīng)。
10.加入200μl RNase-free水或1×液相RNase Erasol(能滅活殘留的RNase，而 RNase-free水無(wú)此功能)，用移液槍仔細(xì)吹打離心管管底和管壁離心面的膜狀RNA沉淀，溶液將呈混濁狀，含少量不溶物。由于不溶沉淀物中含有RNA，所以不要離心后取上清使用，必須取混合液使用，哪怕很渾濁。
11.直接取適量用于RT-PCR，如果溶于200uL水，同時(shí)樣品使用量不超過(guò)RT-PCR體系的 1/2，不溶物一般不會(huì)影響RT-PCR。剩余樣品可以室溫放置2小時(shí)，也可保存于-80℃保存一個(gè)月。