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　　豬偽狂犬病毒實(shí)時熒光PCR試劑盒使用說明
　　【試劑盒簡介】
　　豬偽狂犬病毒實(shí)時熒光PCR試劑盒，采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)檢測豬血清和組織中的PRV，適用于PRV的檢測、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
　　【原理】
　　提取DNA作為模板，在DNA聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火和中溫延伸的多次循環(huán)，使特異DNA片段的拷貝數(shù)放大數(shù)百萬倍。將擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行電泳、染色后，在紫外燈下，肉眼可見DNA片段的擴(kuò)增帶。
　　【試劑盒組份】

注：塑料袋內(nèi)試劑（陽性對照、蛋白酶K、PCR反應(yīng)液A和B）-20 ℃凍存，其他室溫保存。

　　
　　【豬偽狂犬病毒實(shí)時熒光PCR試劑盒操作方法】
　　一、病毒DNA的提取
　　1.取出已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分別加入600µL抽提液（用抽提液之前不要晃動，不要吸到上層保護(hù)液），用力顛倒10次混勻，12,000rpm離心10min。
　　2.取500µL上清置于滅菌離心管中，加入500µL異丙醇，混勻，置液氮中3min或-70℃冰箱中30min。取出樣品管，室溫融化，13,000rpm離心15min。
　　3.棄上清，沿管壁緩緩加入1mL洗滌液，輕輕旋轉(zhuǎn)一周后倒掉，將離心管倒扣于吸水紙上1min，再將離心管真空抽干15min或37℃烘干。
　　4.用30µL無菌水溶解沉淀，作為模板備用。
　　二、樣品制備
　　1樣品采集：病死或撲殺的豬，取大腦海馬背側(cè)皮層、中腦、腦橋、扁桃體、淋巴結(jié)等組織；待檢活豬，用棉拭子取鼻腔分泌物，置于50%甘油生理鹽水中，或用注射器取血5mL，2～8℃保存。（要求送檢病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。）
　　2樣品處理：
　　2.1組織樣品的處理：稱取組織0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理鹽水繼續(xù)磨至無塊狀物；然后將樣品轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心5min，取上清100µL于1.5mL滅菌離心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混勻后37℃溫育1h。
　　2.2全血樣品的處理：待血凝后取血清放于離心管中，8000rpm離心5min，取上清100µL于1.5mL滅菌離心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混勻后37℃溫育1h。
　　2.3陽性對照的處理：混勻后取100µL于1.5mL滅菌離心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混勻后37℃溫育1h。
　　2.4陰性對照的處理：混勻后取100µL于1.5mL滅菌離心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混勻后37℃溫育1h。
　　三、PCR
　　1.反應(yīng)體系：分別取16µLPCR反應(yīng)液A（用前混勻）、2µLPCR反應(yīng)液B（用前混勻）和2µL模板DNA，混勻。
　　2.反應(yīng)程序：在PCR儀上運(yùn)行以下程序：94℃3min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。
　　四、電泳
　　1.制膠：用50倍稀釋的TAE電泳緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠。
　　2.電泳：待膠凝固后，取5µLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm的電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳。
　　3.染色：取50倍稀釋的TAE電泳緩沖液30mL，加入10µL染色液，混勻后將膠浸泡30min，于紫外燈下觀察結(jié)果。
　　【結(jié)果判斷】
　　陽性對照出現(xiàn)400bp擴(kuò)增帶，陰性對照無帶出現(xiàn)（引物帶除外）時，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)400bp擴(kuò)增帶為豬偽狂犬病毒陽性，否則為陰性。
　　【需用但未提供的材料】
　　組織研磨器、眼科剪、眼科鑷、一次性注射器、瓊脂糖、滅菌1.5mL離心管和吸頭（10µL、200µL、1000µL）。
　　【豬偽狂犬病毒實(shí)時熒光PCR試劑盒注意事項(xiàng)】
　　1．本試劑盒有效期為6個月，不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的組分不要混用。
　　2．所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲存，使用時拿到室溫下，使用后立即放回。