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高效液相色譜儀日常維護(hù)
具體維護(hù)內(nèi)容
1.流動(dòng)相
1.1溶劑瓶
a) 棕色玻璃瓶會(huì)避免藻類的生長(zhǎng)，適用于盛放水及緩沖液相;
b) 流動(dòng)相應(yīng)經(jīng)過0.45um或更小孔徑的濾器過濾(Waters UPLC使用0.22μm濾膜過濾)，以免其中微粒性阻塞毛細(xì)管，使用濾膜時(shí)區(qū)別使用有機(jī)膜與水膜。
1.2流動(dòng)相效期的管理
a) 流動(dòng)相為純有機(jī)相的效期為1個(gè)月(長(zhǎng)時(shí)間使用時(shí)注意溶液狀態(tài)，使用前觀察是否有絮狀物，瓶體有無沉淀，下同);
b) 有機(jī)相比例≥50%，效期為3周;有機(jī)相比例為20%~50%效期為2周;有機(jī)相比例≤20%效期為1周(長(zhǎng)時(shí)間使用時(shí)注意溶液狀態(tài));
c) 不含有機(jī)相的緩沖鹽效期為3天
d) 純化水當(dāng)天配置、使用
1.3溶劑過濾器
Ⅰ溶劑過濾器檢查方法
a) 擰開脫氣機(jī)出口或比例閥入口管線，并使液面高于出口30cm此時(shí)溶劑會(huì)因?yàn)橹亓α鞒觯摎鈾C(jī)或溶劑過濾頭堵塞時(shí)，溶劑會(huì)流出不暢或不流出。
b) 查看過濾器是否變色。
c) 臨時(shí)取下過濾器，檢查柱前壓力是否正常。
a) 玻璃濾頭：將堵塞的溶劑過濾器從瓶頭組件中拿下，先用水沖洗殘留溶劑，然后將過濾器放在裝有濃硝酸溶液(35%)的燒杯里浸一小時(shí)，純水*沖洗過濾器。嚴(yán)禁使用超聲波清洗機(jī)清洗，將過濾器重新裝好，僅適用于Agilent液相。
b) 金屬濾頭：將堵塞的溶劑過濾器從瓶頭組件中拿下，先用水沖洗殘留溶劑，然后將過濾器放在50%異丙醇溶液的燒杯里超聲清洗30分鐘，再使用純水超聲清洗2次(每次20min)，清洗后將過濾器重新裝好，適用于Thermo Fisher、Shimadzu、Waters液相。
維護(hù)周期：建議每月清洗一次，長(zhǎng)時(shí)間使用緩沖鹽可適當(dāng)提高清洗頻率。
2.脫氣機(jī)
2.1工作原理
真空脫氣機(jī)由一個(gè)四通道真空箱和一個(gè)真空泵，壓力傳感器及控制電路構(gòu)成。
溶劑瓶中的溶劑在泵的抽動(dòng)下流過真空箱內(nèi)的特殊管狀塑料膜。當(dāng)溶劑經(jīng)過真空管時(shí)，溶劑中溶解的氣體將滲過塑料膜進(jìn)入真空箱。到達(dá)真空脫氣機(jī)出口時(shí)，溶劑幾乎已被*脫氣而不含有任何氣體。
2.1脫氣機(jī)脫氣狀況判斷方法
打開Purge閥(Waters UPLC可設(shè)置為灌注溶劑狀態(tài))，設(shè)定泵的流速2ml/min，提起當(dāng)前所使用溶劑瓶?jī)?nèi)的溶劑過濾頭，使之脫離液面一小段時(shí)間，此時(shí)溶劑傳送管內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一小段氣泡，放下過濾頭，讓此段氣泡通過脫氣機(jī)，如果脫氣機(jī)正常，氣泡應(yīng)消失或縮小。
2.2清洗在線脫氣機(jī)及比例閥方法
在長(zhǎng)期使用水相或緩沖鹽的通路，使用純水沖洗后，再使用甲醇沖洗，可以打開Purge閥，使用5ml/min的流速(Waters UPLC可設(shè)置為灌注溶劑狀態(tài)) 。污染比較嚴(yán)重時(shí)，可以使用異丙醇清洗。
3.四元/二元泵模塊
3.1溶劑比例閥
3.1.1分類
Ⅰ)垂直式比例閥：垂直放置于四元泵中，如Agilent、Thermo Fisher液相。
Thermo Fisher U-3000溶劑比例閥
比例閥A、D通道位于上側(cè)，B、C位于比例閥下側(cè)。因此建議將A通道放入有機(jī)相多的溶劑中;B通道放入水相或緩沖液中;C通道放入純有機(jī)相中，建議使用乙腈，作為沖洗溶劑;D通道固定放入10%乙腈水溶液中，作為置換溶劑及洗針和灌注注射器。
Agilent 1260溶劑比例閥
比例閥位置是A、D通道位于下側(cè)，B、C位于比例閥上側(cè)。因此建議將A通道放入水相或緩沖液中;B通道放入有機(jī)相多的溶劑;C通道放入純有機(jī)相中，建議使用乙腈，作為沖洗溶劑;D放入10%乙腈水溶液中，作為置換溶劑。
Ⅱ)水平式比例閥：水平放置于四元泵中，如Waters，Shimadzu液相
水平式比例閥使用
建議通道使用情況與安捷倫一致，A通道放入水相或緩沖液中;B通道放入有機(jī)相多的溶劑;C通道放入純有機(jī)相中，建議使用乙腈，作為沖洗溶劑;D放入10%乙腈水溶液中，作為置換溶劑。
Ⅲ)二元泵因只有兩個(gè)通道，建議A通道放入水相或緩沖液中;B通道放入有機(jī)相多的溶劑。
3.1.2溶劑比例閥串液判斷方法
使用兩通連接系統(tǒng)，設(shè)定泵的流速1ml/min，每個(gè)通道各占25%流量，提起所有通道的溶劑過濾頭，使之脫離液面一小段時(shí)間，此時(shí)溶劑傳送管內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一小段氣泡，放下過濾頭，當(dāng)氣泡至管線中間位置時(shí)，關(guān)閉流速，在氣泡處標(biāo)記，只開其中一個(gè)通道流速觀察其他三個(gè)通道氣泡位置變化，若無變化，則該通道無串液?jiǎn)栴}，反之存在串液?jiǎn)栴}，同理檢查其他通道是否存在問題。
幻燈片12
3.2柱塞密封清洗
a) 當(dāng)泵頭安裝有清洗附件時(shí)，由于該附件中也有密封墊，這樣就會(huì)增加活塞桿運(yùn)動(dòng)時(shí)的阻力，所以開泵前一定先用密封清洗液沖洗柱塞密封墊，濕潤(rùn)柱塞桿。
b) 建議使用10%異丙醇水溶液(或10%甲醇水溶液)作為密封清洗液，10%異丙醇水溶液(或10%甲醇水溶液)有助于降低水的表面張力，提高潤(rùn)濕效率，快速溶解析出鹽，并有抑菌作用，有效期為兩周。
c) 實(shí)驗(yàn)開始前確保柱塞密封清洗功能已打開，清洗液不可循環(huán)使用，隨時(shí)觀察泵清洗液是否充足，及時(shí)添加泵清洗液。
d) 柱塞密封清洗方法
Thermo Fisher、Waters液相內(nèi)置程序自動(dòng)開啟;
Agilent需要手動(dòng)打開，設(shè)置定期清洗每30min清洗0.1min;
Shimadzu液相需要手動(dòng)清洗，使用的島津液相每天使用注射器吸取清洗液沖洗2 min。
4.進(jìn)樣系統(tǒng)
4.1自動(dòng)洗針功能
吸取樣品時(shí)，進(jìn)樣閥處于旁路位置，自動(dòng)洗針可以立即洗去針外表面上殘留的樣品，當(dāng)進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)回到主流路時(shí)，定量管和針內(nèi)所有的樣品都被沖洗到色譜柱中。這種結(jié)合洗針和沖洗管路的設(shè)計(jì)可以把攜留效應(yīng)減低到最小的程度。
Thermo Fisher、Waters、Shimadzu及AgilentⅡ代液相的自動(dòng)洗針功能，連接專門通路，自動(dòng)填充溶劑清洗;AgilentⅠ代液相采用在液相小瓶中清洗的方式，需要設(shè)置清洗小瓶位置并且去掉小瓶的蓋墊，防止少量樣品留在密封墊上，造成污染。
洗針液以能溶解待測(cè)樣品為宜，可有效減少殘留污染。建議使用10%的甲醇或乙腈作為洗針液，Thermo Fisher液相使用D通道，即10%乙腈作為洗針液，對(duì)于特殊樣品需要配制專門溶劑。
4.2計(jì)量裝置
a)Thermo Fisher、Waters、Shimadzu液相采用計(jì)量注射器量取樣品液，在運(yùn)行前需要灌注注射器以排除注射器內(nèi)氣泡，以防計(jì)量不準(zhǔn);
b)Agilent液相采用計(jì)量泵方式，無注射器不需灌注。
5色譜柱
反相色譜柱維護(hù)，通常使用純水和有機(jī)溶劑，水主要是作為沖洗掉色譜柱中的鹽和其他添加劑，而有機(jī)溶劑則是用來沖洗掉一些在色譜柱上有較強(qiáng)保留的污染物;
*置換色譜柱中的流動(dòng)相，需要至少十倍柱體積，一根常用的4.6×150mm和4.6×250mm的色譜柱柱體積大約分別是1.5mL、2.5ml，按照常用的1mL/min的流速，分別至少需要15min、25min的時(shí)間。
6紫外檢測(cè)器
6.1流通池的清洗
在不連接色譜柱的情況下先用高純水沖洗20分鐘，然后用異丙醇(或5%硝酸，流通池污染嚴(yán)重時(shí)采用，慎用))沖洗2小時(shí)，最后用高純水沖洗，可根據(jù)污染情況調(diào)整沖洗時(shí)間，若正常沖洗無效，反沖檢測(cè)器。適用于VWD、DAD的流通池。
6.2流通池耐壓
注意不同檢測(cè)器流通池耐壓?jiǎn)栴}，盡量避免使用pH>9.5的流動(dòng)相，以防腐蝕流通池石英窗，避免使用可能析晶的流動(dòng)相，防止流通池堵塞;VWD 40bar，DAD 120bar，MWD 120bar，F(xiàn)LD熒光 20bar，RID 示差5bar，RID、FLD永遠(yuǎn)是最后一個(gè)檢測(cè)器。
6.3檢測(cè)器燈維護(hù)
檢測(cè)器的燈一般在流通池有溶液連續(xù)流出幾分鐘后再開啟，若流通池中有氣泡，則會(huì)提示漂移過大無法通過自檢和校正;
檢測(cè)器的氘燈或鎢燈不可經(jīng)常關(guān)閉，每開關(guān)一次燈的壽命損失約30小時(shí)，若儀器中途不需做樣，可設(shè)置低流速，長(zhǎng)時(shí)間不使用可關(guān)機(jī)。
7色譜系統(tǒng)
7.1儀器的過渡及流動(dòng)相的過渡處理
a)使用儀器前，使用10%乙腈沖洗系統(tǒng)10~30min，當(dāng)流動(dòng)相含緩沖鹽時(shí)，連接色譜柱，繼續(xù)使用10%乙腈沖洗系統(tǒng)約20min(根據(jù)柱體積來確定過度時(shí)間，至少10倍柱體積)，以置換色譜柱內(nèi)保存液;
b)Purge注意事項(xiàng)
更換所需流動(dòng)相，若流動(dòng)相分別使用緩沖鹽和純有機(jī)相兩個(gè)通道時(shí)，當(dāng)purge完其中一個(gè)通道后，使用10%乙腈purge 2 min左右，再purge另外的一個(gè)通道，放置防止水相與有機(jī)相在比例閥至泵后管路中混合產(chǎn)生結(jié)晶堵塞管路;將兩通道比例設(shè)置完成后關(guān)閉purge閥，開始平衡色譜柱;
c)儀器使用后，首先將使用到的管路放入10%乙腈中，使用10%乙腈沖洗色譜系統(tǒng)30~50min，更換為90%乙腈沖洗30min，使用兩通替換色譜柱，將四個(gè)通道放入10%乙腈中或50%異丙醇中沖洗保存。
7.2儀器的清洗維護(hù)
a)液相的四個(gè)通道使用50%異丙醇沖洗過夜，在沖洗過程中每隔一段時(shí)間切換進(jìn)樣閥的主路和旁路，用于清洗六通閥，長(zhǎng)時(shí)間未清洗的儀器可以適當(dāng)提高異丙醇比例。
b)當(dāng)進(jìn)樣的樣品濃度較高時(shí)，設(shè)置洗針序列，進(jìn)樣10%有機(jī)相(可根據(jù)樣品溶解度選擇合適的洗液，一般不含鹽)，兩分鐘進(jìn)樣一次，運(yùn)行10針以上，可以沖洗干凈。
7.3色譜用溶液、溶劑污染防范
a)各(色譜)試劑只能倒出，不得用器具移取或者將剩余倒回;
b)將甲醇、乙腈可倒入小體積溶劑瓶或燒杯中，方便使用且避免污染;
c)當(dāng)稀釋劑中含有機(jī)相時(shí)，避免使用塑料滴管，防止有機(jī)相溶解塑料在色譜系統(tǒng)中產(chǎn)生鬼峰;
d)溶劑瓶注意封口，當(dāng)兩個(gè)通道放入一個(gè)瓶中時(shí)，使用封口膜密封，防止異物(注意封口膜老化掉入)落入其中。
7.4捕集小柱使用注意
捕集小柱可有效避免流動(dòng)相中的雜質(zhì)對(duì)基線的干擾，主要應(yīng)用于梯度洗脫體系中;
沖洗過渡色譜系統(tǒng)后，首先使用梯度流動(dòng)相中有機(jī)相比例最大的比例沖洗系統(tǒng)至基線平衡，再更換為初始比例，時(shí)間為梯度中設(shè)置的平衡時(shí)間，不管是否平衡，立即運(yùn)行序列，空白進(jìn)至少3針保證系統(tǒng)平衡。
7.5常見問題解析
保留時(shí)間不穩(wěn)定
a)首先觀察保留時(shí)間是否有規(guī)律的變化，并同時(shí)觀察壓力是否穩(wěn)定;
b)若壓力穩(wěn)定而保留時(shí)間呈有規(guī)律變化，多數(shù)是色譜柱未平衡好，特別是含有鹽的流動(dòng)相，需較長(zhǎng)的時(shí)間去平衡;
c)若壓力穩(wěn)定而保留時(shí)間無規(guī)律變化，請(qǐng)檢查溶劑過濾頭及真空腔是否有堵塞，再平衡色譜柱足夠時(shí)間，如仍然不佳，可更換一色譜柱;
d)若壓力不穩(wěn)定，請(qǐng)檢查造成壓力不穩(wěn)定的因素，如：漏液，排液時(shí)間不足夠，鹽濃度過高導(dǎo)致鹽析，主動(dòng)閥比例閥內(nèi)漏等。
峰面積重現(xiàn)性不好
a)首先觀察壓力是否穩(wěn)定，以及觀察峰面積變化是否有規(guī)律。
b)若壓力不穩(wěn)定，請(qǐng)檢查造成壓力不穩(wěn)定的因素，如漏液，排液時(shí)間不足夠，鹽濃度過高導(dǎo)致鹽析，主動(dòng)閥比例閥內(nèi)漏等;
c)若壓力穩(wěn)定但峰面積呈無規(guī)律變化。請(qǐng)檢查樣品是否足夠，確認(rèn)樣品的穩(wěn)定性，必要時(shí)重新配制，檢查進(jìn)樣閥是否漏液等;
d)若壓力穩(wěn)定且峰面積呈規(guī)律變化，多數(shù)為色譜柱未平衡好。
基線不穩(wěn)定
a)基線漂移
色譜柱未平衡好，柱溫未穩(wěn)定，流動(dòng)相變化等。
b)基線噪音
流動(dòng)池有氣泡，流通池污染;
色譜柱和或系統(tǒng)受污染;
燈能量不足，光路臟;
外界因素影響，如電源，溫度和濕度、震動(dòng)等。