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PCR反應(yīng)體系,有哪些?
閱讀:7244 發(fā)布時(shí)間:2021-8-4PCR板是一種在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)中主要作為參與擴(kuò)增反應(yīng)的引物、Taq DNA聚合酶、dNTP、模板核酸、Mg、緩沖液等的承載物。
PCR反應(yīng)體系:
1. 緩沖液
標(biāo)準(zhǔn)的緩沖液含 1pmol/ml Tris ·HCl,其 pH 為 8.3-9.0(室溫),而在延伸溫度(72 ℃)下,pH 值接近 7.2 。緩沖液中含有一種二價(jià)陽離子,用于激活 DNA 聚合酶的活性中心,一般使用 Mg2+。
2.dNTP
脫氧核糖核苷三磷酸的縮寫,是包括 dATP, dGTP, dTTP, dCTP 等在內(nèi)的統(tǒng)稱,即合成新的 DNA 鏈的材料。4 種 dNTP 的濃度相等,總濃度一般為 200pmol/ml (即飽和濃度)。dNTP 可與 Mg2+ 結(jié)合,使游離的 Mg2+ 濃度下降,影響 DNA 聚合酶的活性。
3. 引物
引物是一段短的單鏈 DNA 片段,可結(jié)合在核酸鏈上與之互補(bǔ)的區(qū)域,其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點(diǎn),DNA 聚合酶可由其 3′端開始合成新的核酸鏈。引物長度一般以 18~30bp 為宜,過短則降低特異性,過長則會(huì)引起引物間的退火而影響有效擴(kuò)增,同時(shí)也增加引物合成的成本。引物的堿基順序不能與非擴(kuò)增區(qū)有同源性。
4. 模板
模板是一段單鏈或者雙鏈 DNA,提供用于進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增的原始信息。對模板的純度要求低,但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA 聚合酶抑制劑、DNA 結(jié)合蛋白等。模板 DNA 應(yīng)該盡量保持低溫保存。
5.Taq DNA 聚合酶
Taq DNA 聚合酶以 DNA 為復(fù)制模板,從將 DNA 由 5' 端點(diǎn)開始復(fù)制到 3' 端的酶。DNA 聚合酶的主要活性是催化 DNA 的合成(在具備模板、引物、dNTP 等的情況下)及其相輔的活性。必須一直保存于-20℃,內(nèi)含甘油保存。最適反應(yīng)溫度 72 ℃,即延伸溫度。通常在配制 PCR 體系的最后加入。
材質(zhì):
其本身材質(zhì)在當(dāng)今主要以聚丙烯(PP)為主,能更好適應(yīng)PCR反應(yīng)過程中反復(fù)高低溫設(shè)定,并且能夠?qū)崿F(xiàn)高溫高壓滅菌操作。為配合排槍、PCR儀等實(shí)現(xiàn)高通量操作,較常使用的為96孔或384孔的PCR板。板型符合SBS國際標(biāo)準(zhǔn),且為適應(yīng)不同廠家的PCR儀,根據(jù)裙邊設(shè)計(jì)又可分為無裙邊、半裙邊、升裙邊和全裙邊四種設(shè)計(jì)模式。
常見顏色:
有透明和白色,其中白色更適合用于新型的實(shí)時(shí)熒光定量PCR。
用途:
廣泛應(yīng)用于遺傳、生化、免疫、醫(yī)藥等領(lǐng)域,不僅應(yīng)用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究,還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方,屬于實(shí)驗(yàn)室一次性易耗品。