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DNA提取試劑盒的保存與操作方法
閱讀：1731 發(fā)布時間：2022-7-19DNA提取試劑盒是根據(jù)氯.化芐法構建的，能夠從樣本中提取基因組DNA的試劑盒。氯.化芐具有能將含有纖維素等的細胞壁中的羥基芐基化，從而破壞細胞壁的特性。本制品利用了氯.化芐的這一特性，將植物樣品凍結融解后，再使用Pipet Tip的尖.端將植物樣品在Microtube壁上數(shù)次按壓即可破壞細胞壁。本法與傳統(tǒng)方法相比，省去了液氮研磨等煩瑣步驟，有利于一次性處理大量樣品。而且，本制品經過了改良，熱處理時間只需15分鐘，使用本制品從實驗開始至水相回收只需30分鐘時間。得到的基因組DNA可以進行PCR擴增及限制酶處理等。
保存方法
室溫。低溫保存可能會有沉淀析出。如果發(fā)生析出現(xiàn)象，請于50℃溶解后，再于室溫保存。
操作方法
全套操作約需1小時，分勻漿、細胞裂解、除蛋白、DNA純化等步驟，詳細說明如下。
勻漿和細胞裂解:
使用不同的實驗材料需采用不同的勻漿步驟，具體說明如下:
【從動物組織中提取基因組DNA】
使用研缽進行勻漿時:
① 取1~100 mg的動物組織或人組織移入冰浴預冷的研缽中，快速用力展研成勻漿。
注)下列組織請加液氮研磨至粉末狀。
A.富含DNA酶的胰臟、脾臟、胸腺、淋巴等組織。
B.富含膠原蛋白的皮膚、肌腱等組織。
C.富含角質蛋白的組織或堅硬的組織(如骨骼)等。
② 加入650 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1，溫和研磨30秒鐘。
注)使用上述①-注)的實驗材料時，請在加入Solution A及RNase A1后，將研缽置于65℃水浴上研磨1分鐘。
③ 收集650 μl研磨好的組織勻漿液移至Collection Tube中。如果勻漿體積不足650 μl，請補充Solution A至650 μl，65℃保溫5分鐘。
使用研磨棒進行勻漿時:
① 取1~100 mg的動物組織或人組織移入冰浴預冷的Collection Tube 中，用研磨棒快速研磨成糊狀。
② 加入350 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1后用研磨棒快速研磨成勻漿。
③ 加入350 μl的Solution A將研磨棒上的勻漿沖入Collection Tube中，充分振蕩混合后，65℃保溫5分鐘。
【從植物材料或植物培養(yǎng)細胞中提取基因組DNA】
① 按下表稱取適量的新鮮植物材料(如選用的是冷凍干燥植物材料，則用量減半)，剪成小塊放入研缽中，加入液氮，待樣品冷凍*后快速、用力研磨至粉末狀。研磨時應間斷加入液氮以防止材料融化。
植物材料種類
植物材料使用量*
植物花、葉片
10~100 mg
植物莖
60~240 mg
植物根
80~240 mg
植物種子
80~240 mg
* 如選取植物的根、種子等樣品時，因其基因組DNA含量很低，需使用超過表格中所示的參數(shù)用量，此時請分兩管進行步驟1~6的實驗操作，在步驟7的操作中再將各管溶液分次加入至同一Spin Column中過濾，使各管的基因組DNA結合到同一個Spin Column上。
如從培養(yǎng)的植物細胞中提取基因組DNA，請離心收集2×103~1×107的培養(yǎng)植物細胞，加入150 μl水充分懸浮細胞后移入研缽中，加入液氮后快速、用力研磨至粉末狀。
注)樣品研磨應充分，否則將會嚴重影響基因組DNA的收率。
② 將研缽移至65℃水浴，當樣品粉末剛開始融化時，向研缽中加入700 μl的Solution A和1.2 μl的RNase A1，用力碾磨30秒。
③ 收集650 μl研磨好的組織勻漿移至Collection Tube中。如勻漿體積不足650 μl，請補充Solution A至650 μl。65℃保溫15分鐘。
注)處理富含纖維的根/莖等植物材料或富含淀粉、蛋白質的種子等時，可延長水浴時間至60分鐘。
【從全血中提取基因組DNA】
① 取10~250 μl的全血(含抗凝劑)加入至Collection Tube中。
② 加入500 μl的Solution A。
③ 加入1 μl的RNase A1，激烈振蕩15秒鐘后，冰浴5分鐘。
注) 人與動物的抗凝全血的一次處理量為≤250 μl;禽類、兩棲類的抗凝全血的一次處理量為≤10 μl。
【從培養(yǎng)細胞中提取基因組DNA】
三.使用懸浮培養(yǎng)的動物細胞時:
① 使用Collection Tube收集1×105~1.5×107的細胞懸浮液，5,000 rpm離心5分鐘，棄上清(細胞培養(yǎng)液)。
② 加入150 μl的滅菌蒸餾水或PBS懸浮細胞。
③ 加入500 μl的Solution A和0.8 μl的RNase A1，激烈振蕩15秒鐘，然后室溫靜置1分鐘。
四.使用貼壁細胞時:
① 棄盡培養(yǎng)液，向培養(yǎng)皿中加入650 μl的Solution A，室溫靜置1分鐘。
注)96孔板等的每個孔中一次容納不了650 μl 溶液時，請分數(shù)次處理細胞。
② 用移液槍的槍頭吹落貼壁培養(yǎng)細胞，取650 μl的細胞懸浮液轉移至Collection Tube中。
③ 加入0.8 μl的RNase A1，激烈振蕩15秒鐘，然后室溫靜置1分鐘。
2. 加入400 μl的Solution B，振蕩混合。
3. 加入1 ml的4℃預冷的Solution C，充分混勻后，12,000 rpm離心2分鐘。
4. 棄去上層有機相，再加入1 ml的4℃預冷的Solution C，充分混勻后，12,000 rpm離心2分鐘。
5. 棄去上層有機相，然后將水相溶液(無色下層)轉移至置于Collection Tube上的Filter Cup中，12,000 rpm離心1分鐘。
注)有機相(上層)帶有顏色，請務必除盡，否則會阻礙DNA結合到DNA制備膜上。相間沉淀不必考慮，在過濾時將被去除。
6. 棄Filter Cup，在濾液中加入400 μl的DB Buffer，混合均勻。
7. 將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。將上述操作6混合溶液轉移至Spin Column中，12,000 rpm離心1分鐘，棄濾液。
8. 將500 μl的Rinse A加入至Spin Column中，12,000 rpm離心30秒鐘，棄濾液。
9. 將700 μl的Rinse B加入至Spin Column中，12,000 rpm離心30秒鐘，棄濾液。
注)請沿Spin Column管壁四周加入Rinse B，這樣有助于*沖洗沾附于管壁上的鹽份。
10. 重復操作步驟9。
11. 將Spin Column安置于新的1.5 ml的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入50~200 μl的滅菌蒸餾水或Elution Buffer，室溫靜置1分鐘。
注)把滅菌蒸餾水或Elution Buffer加熱至65℃使用時有利于提高洗脫效率。
12. 12, 000 rpm離心1分鐘洗脫DNA。
如果實驗室備有適合于Spin Column接口的負壓裝置，可從上述操作步驟6完成以后進行以下操作。
7. 將試劑盒中的Spin Column插到負壓裝置的插口上，將上述操作步驟6的混合溶液轉移到Spin Column中，開啟調節(jié)負壓裝置，緩慢吸走Spin Column中的溶液(流速控制在1滴/秒)。
8. 將負壓調至最大，向Spin Column中加入500 μl的Rinse A，吸盡Spin Column中溶液。
9. 向Spin Column中加入700 μl的Rinse B，吸盡Spin Column中溶液。
注)請沿Spin Column管壁四周加入Rinse B，這樣有助于*沖洗沾附于管壁上的鹽份。
10. 重復操作步驟9。然后從負壓裝置上取下Spin Column，將其安置于試劑盒中的Collection Tube上，12, 000 rpm離心1分鐘。
11. 將Spin Column安置于新的1.5 ml的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入50~200 μl的滅菌蒸餾水或Elution Buffer，室溫靜置1分鐘。
注)把滅菌蒸餾水或Elution Buffer加熱至65℃使用時有利于提高洗脫效率。
12. 12, 000 rpm離心1分鐘洗脫DNA。
分類
DNA提取試劑盒主要可以分為以下幾大類:小量全血基因組DNA提取試劑盒、中量全血基因組DNA提取試劑盒、組織/細胞基因組DNA提取試劑盒、中量/大量組織/細胞基因組DNA提取試劑盒、全血/組織/細胞基因組DNA提取試劑盒、CTAB植物基因DNA提取試劑盒、新型植物基因組DNA提取試劑盒、酵母基因組DNA提取試劑盒、M13噬菌體單鏈基因組DNA提取試劑盒。