化工儀器網(wǎng)
技術文章
琥珀酸脫氫酶的提取與測定
閱讀：1145 發(fā)布時間：2022-8-23琥珀酸脫氫酶（Succinate dehydrogenase，簡稱SDH），黃素酶類，屬于細胞色素氧化酶，是TCA循環(huán)中唯.一一個整合于膜上的多亞基酶，在真核生物中，結合于線粒體內膜，在原核生物中整合于細胞膜上，其是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一，可為真核細胞線粒體和多種原核細胞需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子，為線粒體的一種標志酶。
提取
琥珀酸脫氫酶的提取與生理意義
琥珀酸脫氫酶存在于所有有氧呼吸細胞，和線粒體膜牢固結合，是三羧酸循環(huán)中唯.一與內膜結合的酶，是脫氫酶中最重要的酶。迄今為止，已從多種原核和真核組織中分離純化出這種酶，為該酶的酶學研究奠定了基礎。作為膜內酶，琥珀酸脫氫酶與具有脂雙層結構的線粒體膜結合得比較緊密，很難溶解下來，而且其一旦離開膜后，暴露在空氣中會很快失活，因此其提純難度很大。1950年我國著名生物化學家王應睞、鄒承魯、汪靜英等開展對膜蛋白琥珀酸脫氫酶的研究，經(jīng)過反復實驗最后以正丁醇抽提法成功地把琥珀酸脫氫酶從鼠肝組織線粒體膜上溶解下來，得到了高純度的水溶性琥珀酸脫氫酶，其活力比同期國外報道者高出1倍以上，從而奠定了我國在琥珀酸脫氫酶研究領域的領.先地位。其后，Davis等（1971、1977）使用NaClO4從牛心線粒體溶解下此酶；TsukahoHattori和TadashiAsahi（1982）選用離子型去垢劑脫氧膽酸鈉從番薯根線粒體提取SDH；Suraveratum等（2000）對惡性瘧原蟲的琥珀酸脫氫酶進行了純化；夏玉鳳等（2000）以玉米黃化苗為生物材料，通過差速離心獲得線粒體，使用超聲波將其破碎，用2%TritonX-100溶膜，超速離心，硫酸銨沉淀，DEAE-C32層析純化琥珀酸脫氫酶；辛明秀等（2004）用常規(guī)酶學方法從嗜冷酵母（Y18）中分離純化出有催化活性的琥珀酸脫氫酶。
琥珀酸脫氫酶是直接連在電子傳遞鏈上的，氫受體是FAD而不是NAD+，它使琥珀酸氧化為延胡索酸過程中所產(chǎn)生的FADH2與酶結合，將來自FADH2的兩個電子直接傳遞給酶的Fe3+。現(xiàn)有研究表明，琥珀酸脫氫酶由α、β兩個亞基組成，α亞基相對分子質量為70.0×103，含有FAD和兩個鐵硫簇；β亞基相對分子質量為27.0×103，含有一個鐵硫簇。
測定
琥珀酸脫氫酶活力測定方法主要有五種。
硫酸甲酯吩嗪（PMS）反應法
琥珀酸脫氫酶能通過一系列人工電子受體，如與PMS（吩嗪二甲酯硫酸鹽），DCPIP（2，6-二氯酚靛酚）等發(fā)生反應催化琥珀酸的氧化，而借助這些中間產(chǎn)物的顏色變化，通過分光光度計檢測即可加以定量反映，其反應式為：①Succinate+PMS→Fumarate+PMSH2；②PMSH2+DCPIP→PMS+DCPIPH2。DCPIP呈藍色，標準的吸收光譜在600nm處，這種色澤可因其還原而漸次變淡，從而600nm處的光密度的變化與DCPIP含量成正比，測定2.6-DPIP的還原速度可以推算出SDH的活力。一分子DCPIP被還原，即代表一分子琥珀酸被氧化。故可測定此反應系統(tǒng)在600nm處的吸收光度變化，來計算SDH的活性。SDH活性計算：（標準－測定）/標準=μmol/min/mg。
鐵氰.化鉀[K3Fe（CN）6]還原法
以鐵氰.化鉀[K3Fe（CN）6]和琥珀酸鈉為底物，使琥珀酸脫氫酶催化反應將鐵氰化.鉀還原為亞鐵氰.化鉀[K4Fe（CN）6]，K4Fe（CN）6再與Fe3+作用生成普魯士藍，在700nm波長測定吸光值，以檢測普魯士藍之生成量，作為琥珀酸脫氫酶的還原力，吸光值愈高表示琥珀酸脫氫酶活力愈強。
TTC（氯化三苯四氮唑）法
無色TTC（2，3，5-氯化三苯基四唑）作為人造受氫體，它在細胞呼吸過程中接受氫，還原成三苯基甲膳（TF）。后者以紅色晶體的形式存在于細胞內，采用有機溶劑（如甲苯、乙.酸乙醋、三.氯甲烷、丙酮或乙醇等）進行萃取。萃取液測定485nm吸光度后，以TTC還原量表示脫氫酶活性，根據(jù)標準曲線計算TF生成量，進而求出TTC-脫氫酶活性。
MTT法
MTT是一種黃顏色的染料?；罴毎€粒體中琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原MTT，同時在細胞色.素C的作用下生成藍色（或藍紫色）不溶于水的甲臜（Formazana），經(jīng)異丙醇作用顆粒溶解顯色。在通常情況下，甲臜生成量與活細胞數(shù)成正比，因此可根據(jù)光密度570nm處OD值推測出活細胞的數(shù)目。
NBT（氯化硝基四氮唑藍）法
NBT易溶于水，呈淡黃色，以NBT為受氫體，接受由琥珀酸鈉鹽被酶作用而脫下的氫，進而形成紫藍色的沉淀，于反應體系中加入PMS，混勻，37℃保溫30min，之后加入TCA終止反應。加異丙醇溶解顯色，混勻，即可于548nm測OD值。規(guī)定：30min內548nm下OD值為1.0時的酶量為1個活力單位。比活力=活力單位數(shù)/毫克蛋白。