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DNA提取試劑盒的幾種提取步驟
閱讀：926 發(fā)布時(shí)間：2022-12-23DNA提取試劑盒是根據(jù)lv/化/芐/法構(gòu)建的，能夠從樣本中提取基因組DNA的試劑盒。lv/化/芐具有能將含有纖維素等的細(xì)胞壁中的羥基芐基化，從而破壞細(xì)胞壁的特性。本制品利用了lv/化/芐的這一特性，將植物樣品凍結(jié)融解后，再使用Pipet Tip將植物樣品在Microtube壁上數(shù)次按壓即可破壞細(xì)胞壁。本法與傳統(tǒng)方法相比，省去了液氮研磨等煩瑣步驟，有利于一次性處理大量樣品。而且，本制品經(jīng)過了改良，熱處理時(shí)間只需15分鐘，使用本制品從實(shí)驗(yàn)開始至水相回收只需30分鐘時(shí)間。得到的基因組DNA可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增及限制酶處理等。
操作方法：
全套操作約需1小時(shí)，分勻漿、細(xì)胞裂解、除蛋白、DNA純化等步驟，詳細(xì)說明如下。
勻漿和細(xì)胞裂解，使用不同的實(shí)驗(yàn)材料需采用不同的勻漿步驟，具體說明如下：
【從動物組織中提取基因組DNA】
使用研缽進(jìn)行勻漿時(shí)：
① 取1～100 mg的動物組織或人組織移入冰浴預(yù)冷的研缽中，快速用力展研成勻漿。
注）下列組織請加液氮研磨至粉末狀。
A．富含DNA酶的胰臟、脾臟、胸腺、淋巴等組織。
B．富含膠原蛋白的皮膚、肌腱等組織。
C．富含角質(zhì)蛋白的組織或堅(jiān)硬的組織（如骨骼）等。
② 加入650 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1，溫和研磨30秒鐘。
注）使用上述①-注）的實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，請?jiān)诩尤隨olution A及RNase A1后，將研缽置于65℃水浴上研磨1分鐘。
③ 收集650 μl研磨好的組織勻漿液移至Collection Tube中。如果勻漿體積不足650 μl，請補(bǔ)充Solution A至650 μl，65℃保溫5分鐘。
使用研磨棒進(jìn)行勻漿時(shí):
① 取1～100 mg的動物組織或人組織移入冰浴預(yù)冷的Collection Tube 中，用研磨棒快速研磨成糊狀。
② 加入350 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1后用研磨棒快速研磨成勻漿。
③ 加入350 μl的Solution A將研磨棒上的勻漿沖入Collection Tube中，充分振蕩混合后，65℃保溫5分鐘。
【從植物材料或植物培養(yǎng)細(xì)胞中提取基因組DNA】
① 按下表稱取適量的新鮮植物材料（如選用的是冷凍干燥植物材料，則用量減半），剪成小塊放入研缽中，加入液氮，待樣品冷凍后快速、用力研磨至粉末狀。研磨時(shí)應(yīng)間斷加入液氮以防止材料融化。
* 如選取植物的根、種子等樣品時(shí)，因其基因組DNA含量很低，需使用超過表格中所示的參數(shù)用量，此時(shí)請分兩管進(jìn)行步驟1～6的實(shí)驗(yàn)操作，在步驟7的操作中再將各管溶液分次加入至同一Spin Column中過濾，使各管的基因組DNA結(jié)合到同一個(gè)Spin Column上。
如從培養(yǎng)的植物細(xì)胞中提取基因組DNA，請離心收集2×103～1×107的培養(yǎng)植物細(xì)胞，加入150 μl水充分懸浮細(xì)胞后移入研缽中，加入液氮后快速、用力研磨至粉末狀。
注）樣品研磨應(yīng)充分，否則將會嚴(yán)重影響基因組DNA的收率。
② 將研缽移至65℃水浴，當(dāng)樣品粉末剛開始融化時(shí)，向研缽中加入700 μl的Solution A和1.2 μl的RNase A1，用力碾磨30秒。
③ 收集650 μl研磨好的組織勻漿移至Collection Tube中。如勻漿體積不足650 μl，請補(bǔ)充Solution A至650 μl。65℃保溫15分鐘。
注）處理富含纖維的根/莖等植物材料或富含淀粉、蛋白質(zhì)的種子等時(shí)，可延長水浴時(shí)間至60分鐘。
【從全血中提取基因組DNA】
① 取10～250 μl的全血（含抗凝劑）加入至Collection Tube中。
② 加入500 μl的Solution A。
③ 加入1 μl的RNase A1，激烈振蕩15秒鐘后，冰浴5分鐘。
注） 人與動物的抗凝全血的一次處理量為≤250 μl；禽類、兩棲類的抗凝全血的一次處理量為≤10 μl。
【從培養(yǎng)細(xì)胞中提取基因組DNA】
一、使用懸浮培養(yǎng)的動物細(xì)胞時(shí)：
① 使用Collection Tube收集1×105～1.5×107的細(xì)胞懸浮液，5,000 rpm離心5分鐘，棄上清（細(xì)胞培養(yǎng)液）。
② 加入150 μl的滅菌蒸餾水或PBS懸浮細(xì)胞。
③ 加入500 μl的Solution A和0.8 μl的RNase A1，激烈振蕩15秒鐘，然后室溫靜置1分鐘。
二、使用貼壁細(xì)胞時(shí)：
① 棄盡培養(yǎng)液，向培養(yǎng)皿中加入650 μl的Solution A，室溫靜置1分鐘。
注）96孔板等的每個(gè)孔中一次容納不了650 μl 溶液時(shí)，請分?jǐn)?shù)次處理細(xì)胞。
② 用移液槍的槍頭吹落貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，取650 μl的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至Collection Tube中。
③ 加入0.8 μl的RNase A1，激烈振蕩15秒鐘，然后室溫靜置1分鐘。
2. 加入400 μl的Solution B，振蕩混合。
3. 加入1 ml的4℃預(yù)冷的Solution C，充分混勻后，12,000 rpm離心2分鐘。
4. 棄去上層有機(jī)相，再加入1 ml的4℃預(yù)冷的Solution C，充分混勻后，12,000 rpm離心2分鐘。
5. 棄去上層有機(jī)相，然后將水相溶液（無色下層）轉(zhuǎn)移至置于Collection Tube上的Filter Cup中，12,000 rpm離心1分鐘。
注）有機(jī)相（上層）帶有顏色，請務(wù)必除盡，否則會阻礙DNA結(jié)合到DNA制備膜上。相間沉淀不必考慮，在過濾時(shí)將被去除。
6. 棄Filter Cup，在濾液中加入400 μl的DB Buffer，混合均勻。
7. 將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。將上述操作6混合溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12,000 rpm離心1分鐘，棄濾液。
8. 將500 μl的Rinse A加入至Spin Column中，12,000 rpm離心30秒鐘，棄濾液。
9. 將700 μl的Rinse B加入至Spin Column中，12,000 rpm離心30秒鐘，棄濾液。
注）請沿Spin Column管壁四周加入Rinse B，這樣有助于沖洗沾附于管壁上的鹽份。
10. 重復(fù)操作步驟9。
11. 將Spin Column安置于新的1.5 ml的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入50～200 μl的滅菌蒸餾水或Elution Buffer，室溫靜置1分鐘。
注）把滅菌蒸餾水或Elution Buffer加熱至65℃使用時(shí)有利于提高洗脫效率。
12. 12, 000 rpm離心1分鐘洗脫DNA。