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蛋白免疫印跡技術的步驟，分為哪五大步？
閱讀：637 發(fā)布時間：2023-8-8免疫印跡（immunoblotting）又稱蛋白質(zhì)印跡（Western blotting），是根據(jù)抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術。由于免疫印跡具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析。結合化學發(fā)光檢測，可以同時比較多個樣品同種蛋白的表達量差異。
基本步驟：
蛋白免疫印跡技術可以分為樣品制備、電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫雜交五個步驟。
一、樣品制備
對于Western Blotting實驗而言,樣品處理是關鍵步驟之一,獲得的蛋白樣品必須均質(zhì)、可溶,并解離成單個多肽亞基,且盡量減少相互間的聚集,使其最終僅依賴本身的分子量大小進行分離。 當目標蛋白的含量很低時,需要選取目標蛋白含量較高的組織或細胞器(如核抽提物),或者通過免疫沉淀等方式進行富集。通常樣品有重組蛋白、細胞和組織等。
二、電泳
將制備好的蛋白樣品加入上樣緩沖液（loading buffer），沸水煮5min。上述操作過程是為了破壞肽鏈間的二硫鍵以及蛋白分子的電荷，使蛋白質(zhì)的遷移率不受蛋白質(zhì)原電荷和形狀的影響，而只取決于蛋白分子量的大小。上樣針上加蛋白樣品，在電泳緩沖液中，蛋白樣品經(jīng)濃縮膠凝縮后，在分離膠中按照分子量大小進行遷移，分子量小的蛋白分子遷移速率快，大分子的蛋白質(zhì)則受到較大的阻力而被滯后，從而實現(xiàn)分子的分離效果。
三、轉(zhuǎn)膜
蛋白電泳結束后，將膠條根據(jù)待檢目標蛋白切至合適大小，等比例準備硝酸纖維素膜（NC膜）或PVDF膜（使用前需在甲醛中浸泡），轉(zhuǎn)移膜孔徑的大小根據(jù)待檢測蛋白的大小選擇，大于20kD的蛋白可用0.45mm的膜，小于20kD的蛋白用0.2mm的膜。然后裝配三明治夾心模型：海綿--三層濾紙--膠--膜--三層濾紙--海綿，放好后，排除各層之間的氣泡，固定好夾子，按固定方向?qū)⑵浞胖迷谵D(zhuǎn)移槽中（保證膠中的蛋白能從膠轉(zhuǎn)移至膜上，從負極向正極移動），轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，防止由于電轉(zhuǎn)移時產(chǎn)熱造成的電阻過大，影響轉(zhuǎn)移效率。
四、封閉
在進行抗體雜交之前,需要采用異源性蛋白質(zhì)先對轉(zhuǎn)印膜進行封閉,防止免疫試劑的非特異性吸附,從而降低背景,增加靈敏度,提高信噪比。常用封閉物有脫脂奶粉和 BSA(稀釋于不同的緩沖液中),但不同的抗原-抗體反應,封閉條件均不相同,沒有適合所有系統(tǒng)的封閉液,具體封閉條件(包括封閉液濃度、緩沖液種類、封閉時間、溫度等)需自行優(yōu)化。
五、免疫雜交
轉(zhuǎn)膜結束后，將膜放至封閉液中（10%脫脂奶粉或1%FBS），室溫搖床上孵育1h。TBST漂洗3遍×10min，然后將膜放入按固定比例稀釋的待檢測蛋白抗體中（一抗），室溫孵育1h或4°C放置過夜。TBST漂洗3遍×10min，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗，室溫搖床上孵育1h。TBST漂洗3遍×10min，加入化學發(fā)光液，避光顯色，顯色時間根據(jù)蛋白條帶出現(xiàn)時間確定。