B-arr2 招募細(xì)胞測定通過 GPCR 激活監(jiān)測 B-arrestin 2 和 AP2 的招募。B-arr2 招募試劑盒用于通過監(jiān)測內(nèi)源性 B-arrestin 2 與其伴侶 AP-2 之間的相互作用來表征化合物對 Beta 抑制蛋白信號通路的影響。
從文獻中得知，在研究 GPCR 背景下的 Beta 抑制蛋白信號通路時，對這種相互作用的藥理學(xué)研究是相關(guān)的。
B-arr2 募集測定監(jiān)測細(xì)胞中 GPCR 激活介導(dǎo)的 B-arrestin 2 募集。Cisbio 的 B-arr2 招募試劑盒具有高度敏感性，可對涉及內(nèi)源 B-arrestin 2 和 AP2 蛋白的化合物進行藥理學(xué)表征。該試劑盒使用兩種標(biāo)記抗體，一種與供體熒光團偶聯(lián)，另一種與受體偶聯(lián)。兩種抗體對 B-arr2 蛋白和 AP2 均具有高度特異性。當(dāng)細(xì)胞中存在 B-arr2/AP2 相互作用時，添加這些綴合物會使供體熒光團與受體緊密接近，從而產(chǎn)生 FRET 信號。其強度與樣品中存在的 B-arrestin 2/AP2 復(fù)合物的數(shù)量成正比。
使用 HTRF 試劑檢測 B-arr2 招募可以在用于培養(yǎng)、刺激、穩(wěn)定和檢測的單板中進行。穩(wěn)定步驟后需要洗滌三次。這種特定的方案能夠在室溫下孵育后檢測未裂解的細(xì)胞和內(nèi)源蛋白，同時保持穩(wěn)定的 HTRF 質(zhì)量。
使用 HTRF 試劑檢測 B-arr2 招募可以在用于培養(yǎng)、刺激、穩(wěn)定和檢測的單板中進行。穩(wěn)定步驟后需要洗滌三次。該特定方案能夠使用非裂解細(xì)胞和內(nèi)源蛋白進行檢測，同時在室溫下孵育后保持穩(wěn)定的 HTRF 質(zhì)量。
B-arr2 招募測定方案的選項 2 通過在室溫下 ON 孵育后去除 80μL 檢測試劑來改善 S/B。
將 Tag-lite SNAP-Beta2R 和 SNAP-V1AR HEK293 細(xì)胞以 100,000 個細(xì)胞/孔接種在 96 孔板中，并在 37°C、5% CO2 下孵育 24 小時。隨后在室溫下處理 5 分鐘（加壓素 V1A 受體）和 30 分鐘（β2 腎上腺素能受體），分別增加稀釋在刺激緩沖液 4 中的加壓素 (V1AR) 和異丙腎上腺素 (Beta2R) 的濃度。接下來除去培養(yǎng)基。 。用 30 µL 穩(wěn)定緩沖液 1 在室溫下穩(wěn)定細(xì)胞 15 分鐘，然后用 100 µl 洗滌緩沖液 1 洗滌 3 次。最后，添加 100 µl B-arr2 募集檢測試劑。在室溫下孵育過夜后記錄 HTRF 信號。
按照類似的方案，通過在室溫下分配逐漸增加濃度的 SR 49059 (V1AR) 和 ICI-118,551 (Beta2R) 30 分鐘，然后添加 15nM（加壓素）和 40nM（異丙腎上腺素）激動劑化合物來表征拮抗劑化合物。
將 Tag-lite SNAP-Beta2R HEK293 細(xì)胞以 100,000 個細(xì)胞/孔接種到 96 孔板中，并在 37°C、5% CO2 下孵育 24 小時。在室溫下用稀釋在刺激緩沖液4中的濃度逐漸增加的一組激動劑化合物處理30分鐘后，除去培養(yǎng)基。用 30 µL 穩(wěn)定緩沖液 1 在室溫下穩(wěn)定細(xì)胞 15 分鐘，然后用 100 µl 洗滌緩沖液 1 洗滌 3 次。最后，加入 100 µl B-arr2 募集檢測試劑。在室溫下孵育過夜后記錄 HTRF 信號。
按照類似的方案，一組拮抗劑化合物的特征是在室溫下分配濃度不斷增加的拮抗劑 30 分鐘，然后添加 30nM 的異丙腎上腺素。
將 Tag-lite SNAP-GLP1R HEK293 細(xì)胞以 100,000 個細(xì)胞/孔接種到 96 孔板中，并在 37°C、5% CO2 下孵育 24 小時。用刺激緩沖液4中稀釋的濃度逐漸增加的Exendin-4在室溫下處理30分鐘后，除去培養(yǎng)基。用 30 µL 穩(wěn)定緩沖液 1 在室溫下穩(wěn)定細(xì)胞 15 分鐘，然后用 100 µl 洗滌緩沖液 1 洗滌 3 次。最后，加入 100 µl B-arr2 募集檢測試劑。在室溫下孵育過夜后記錄 HTRF 信號（測定方案選項 1）。
過夜孵育后執(zhí)行額外步驟，除去 80μL 檢測試劑（測定方案選項 2）。使用與測定方案選項 1 相同的讀板器設(shè)置記錄改進的 HTRF 信號。
B-抑制蛋白通過調(diào)節(jié)激動劑介導(dǎo)的 GPCR 信號傳導(dǎo)在 GPCR 信號傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮核心作用。它們的作用包括介導(dǎo)受體脫敏和再敏化過程，充當(dāng) MAPK1/3 或 AKT1 等 MAPK 通路的信號支架，并參與泛素蛋白連接酶向受體的募集。β-抑制蛋白作為多價接頭蛋白起作用，可以將 GPCR 從 G 蛋白信號傳導(dǎo)模式（從質(zhì)膜傳輸短暫的信號）切換到 β-抑制蛋白信號傳導(dǎo)模式，該模式傳輸一組不同的信號，起始為受體內(nèi)化并穿過細(xì)胞內(nèi)區(qū)室。
在 GPCR 脫敏過程中，B-抑制蛋白與 GRK 磷酸化受體結(jié)合，并在空間上阻止其與 G 蛋白的偶聯(lián)。
然后，B-抑制蛋白通過與 AP2 復(fù)合物的 β-適應(yīng)素亞基相互作用，靶向網(wǎng)格蛋白包被的凹坑中的許多受體進行內(nèi)化，從而將 GPCR 募集到多部分復(fù)合物中。B-arrestin 和 AP2 之間的相互作用是在激動劑刺激后將 GPCR 定位在網(wǎng)格蛋白包被的凹坑內(nèi)的核心初始步驟，因此針對這種相互作用的藥理學(xué)化合物引起了相當(dāng)大的興趣。
內(nèi)化的抑制蛋白受體復(fù)合物運輸至細(xì)胞內(nèi)內(nèi)體。
然后，受體重新敏化需要去除受體結(jié)合的抑制蛋白，以便受體可以去磷酸化并返回質(zhì)膜。β-抑制蛋白參與的程度似乎根據(jù)受體、激動劑和細(xì)胞類型而顯著變化。
提供商 |
上海牧榮生物科技有限公司 | 下載次數(shù) |
16次 |
資料大小 |
1.2MB | 資料類型 |
PDF 文件 |
資料圖片 |
-- | 瀏覽次數(shù) |
267次 |
(空格分隔,最多3個,單個標(biāo)簽最多10個字符)
4
立即詢價
您提交后，專屬客服將第一時間為您服務(wù)