點(diǎn)擊化學(xué)緩沖液適用于含有炔烴的寡核苷酸的合成后綴合。帶有末端炔的寡核苷酸可以使用炔亞磷酰胺合成，或者您也可以在我們的網(wǎng)站上訂購修飾寡核苷酸的合成。
疊氮化物與修飾寡核苷酸的末端炔綴合，形成五元雜環(huán)。這兩個(gè)基團(tuán)（疊氮基和炔烴）在天然生物分子中都極為罕見，因此該反應(yīng)具有高度特異性，可以有效地處理各種任務(wù)。
該反應(yīng)在銅 (I) 存在下、中性 pH 值下進(jìn)行。催化緩沖液含有銅 (II)、醋酸三乙銨 pH 7 和 DMSO。建議使用新配制的 抗壞血酸溶液來還原銅 (II)。
對(duì)于此反應(yīng)，您將需要炔烴修飾的寡核苷酸、疊氮化染料、點(diǎn)擊化學(xué)緩沖液和抗壞血酸。您可以在我們的網(wǎng)站上在線訂購所有試劑。
我們推薦以下方案用于含炔寡核苷酸與疊氮化染料的綴合：
根據(jù)要使用的寡核苷酸的量確定總反應(yīng)體積：
| 寡核苷酸的量 | 總反應(yīng)體積，μL |
|---|---|
| 4至20納摩爾 | 100 |
| 20至40納摩爾 | 200 |
| 40至80納摩爾 | 400 |
| 80 至 600 納摩爾 | 600 |
使用下表計(jì)算標(biāo)記反應(yīng)的試劑體積：
| 試劑 | 體積，微升 | 原液濃度 |
|---|---|---|
| 疊氮化染料 | (寡核苷酸量[nmol])×0.15 | 10 mM DMSO 溶液 |
| 點(diǎn)擊化學(xué)緩沖液 | （總反應(yīng)體積[μL]）×0.67 | 1.5倍 |
| 活化劑 （抗壞血酸） | （總反應(yīng)體積[μL]）×0.02 | 50 mM 水中 |
| 水（用于溶解寡核苷酸） | （總反應(yīng)體積 [μL] - 疊氮化染料溶液的體積 [μL] - 緩沖液的體積 [μL] - 活化劑溶液的體積 [μL]） | — |
準(zhǔn)備疊氮化染料（DMSO 中 10 mM）和活化劑（抗壞血酸，水中 50 mM） 的儲(chǔ)備溶液 。
請(qǐng)記住，抗壞血酸在空氣中很容易氧化。僅使用新配制的活化劑溶液（該溶液在 1 天內(nèi)穩(wěn)定）。要制備儲(chǔ)備溶液，請(qǐng)將 10 mg抗壞血酸溶解在 1.1 mL 水中。
將寡核苷酸溶解在 2 mL 塑料管中 計(jì)算體積的 水中。
添加點(diǎn)擊化學(xué)緩沖液和渦旋。
添加計(jì)算體積的疊 氮化染料儲(chǔ)備溶液并再次渦旋。
（受到推崇的）。將混合物脫氣以除去氧氣。為此，將一次性移液器吸頭連接到塑料或硅膠管，該管連接到裝有惰性氣體（氬氣、氮?dú)饣蚝猓┑臍馄康膲毫φ{(diào)節(jié)器。打開非常弱的氣流并將頭部放入管中，使其比液位高 3-10 毫米，避免接觸液體和管壁。氣流應(yīng)在液體中形成漩渦而不濺出液體。將頭部保持在該位置 10-20 秒。
如果同時(shí)運(yùn)行多個(gè)標(biāo)記反應(yīng)，則可以使用 SpeedVac 型系統(tǒng)進(jìn)行脫氣。為此，將管子放入系統(tǒng)中，打開旋轉(zhuǎn)，打開真空 30-40 秒，然后關(guān)閉真空，同時(shí)向系統(tǒng)輸入端注入惰性氣體。
添加活化劑溶液（抗壞血酸），然后用惰性氣體吹掃管幾秒鐘并關(guān)閉它。
渦旋溶液。如果反應(yīng)過程中形成沉淀，請(qǐng)將管在熱水 (70–95 °C) 中加熱，直至沉淀溶解并渦旋溶液。
讓混合物在室溫下靜置 8-16 小時(shí)。
添加 2M 高氯酸鋰溶液（每 5 體積的反應(yīng)混合物 1 體積），渦旋溶液，并添加額外的純丙酮至 2 mL。
搖動(dòng)管子并使其在-20°C 下靜置 20 分鐘。
以 10,000 RPM 離心 10 分鐘，分離沉淀物。丟棄上清液。
將 1 mL 丙酮添加到沉淀物中。搖動(dòng)管數(shù)次，并以 10,000 RPM 離心 10 分鐘分離沉淀物。丟棄上清液。
讓沉淀物在室溫下在開口管中干燥 1 小時(shí)或?qū)⒐芊湃?65°C 的加熱塊中 10 分鐘。
將沉淀物溶解于水中，并通過HPLC純化目標(biāo)產(chǎn)物
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
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