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應(yīng)用簡介
      腫瘤細胞/癌細胞的耐藥性是腫瘤/癌癥難以gen治的重要原因。體外構(gòu)建的耐藥細胞株，能模擬腫瘤細胞/癌細胞對特異藥物耐藥性的形成過程，有助于人們理解腫瘤細胞/癌細胞獲得耐藥性的機制，篩選獲得抗耐藥性的特異藥物，并對相關(guān)疾病進行有針對性地臨床治療。
原理介紹
      一種藥物作用于某類細胞后，會殺死其中沒有抗性的細胞，而這類細胞中具有抗性的細胞不會被殺死，即進行了選擇。具有抗性的細胞大量繁殖產(chǎn)生很多抗性后代，再用這種藥物時表現(xiàn)出的藥效大大下降的現(xiàn)象就是細胞的耐藥性。采用體外低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊方法誘導腫瘤細胞對特定藥物產(chǎn)生耐藥性，從而構(gòu)建出對特定藥物產(chǎn)生耐藥性的腫瘤細胞株。
實驗方法
      一、檢測親本細胞株的IC50IC50(halfmaximalinhibitoryconcentration),即半抑制濃度,指某一種物質(zhì)對某些生物程序抑制達到50%抑制效果時的濃度。對細胞增殖方面,可以理解為對細胞增殖的抑制效果達到細胞正常增殖水平50%時的藥物濃度。通常用IC50來衡量藥物對細胞的毒性或者細胞 對藥物的耐受能力,在藥物實驗中,常用IC50來評估實驗中使用的藥物濃度。IC50的計算方法很多,常用的有Excel、graphpadprism、SPSS等。
      二、藥物濃度遞增法/大劑量藥物沖擊法
      1、大劑量間隙作用：對數(shù)生長期的細胞接種于培養(yǎng)瓶中，生長至70%～80%匯合時，將處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞置于含有濃度的藥物濃度的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，更換不含藥物培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)，待細胞恢復生長，培養(yǎng)一段時間后更換不含藥物的RPMI-1640（DMEM）胎牛血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞穩(wěn)定生長、進入對數(shù)生長期后，傳代兩次，再將篩選出的細胞在濃度的藥物濃度培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)依這樣不斷改變作用時間，共經(jīng)過1h、2h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h共10個作用時間段，約8個月的培養(yǎng)，終使得細胞能夠在一定濃度的藥物的培養(yǎng)液中持續(xù)穩(wěn)定生長并傳代，然后脫藥培養(yǎng)1個月在檢測細胞的生物特性及耐藥指標。

2、濃度梯度遞增間隙作用：采用藥物濃度遞增培養(yǎng)法沖擊誘導，對數(shù)生長期的細胞接種于培養(yǎng)瓶中，細胞處于60～70%濃度對數(shù)期生長時，加入起始濃度為低濃度的藥物作用24h，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，更換不含藥物培養(yǎng)基，細胞恢復生長后，消化傳代復以低濃度作用細胞24h，待細胞增殖至正常形態(tài)后，重復上述藥物沖擊，每種濃度沖擊8次。待細胞在此濃度穩(wěn)定生長后，提高藥物濃度繼續(xù)培養(yǎng)，藥物依次遞增濃度加藥。藥物誘導歷時大約9個月，直到細胞能夠在濃度的藥物中穩(wěn)定生長。
      三、檢測耐藥細胞株的IC50。
      根據(jù)IC50值計算出耐藥指數(shù)（resistanceindex,RI），RI=耐藥細胞系的IC50/親代細胞系的IC50，RI>5則認為耐藥細胞系的耐藥性符合耐藥株的要求。