在成人肌細(xì)胞收縮中的應(yīng)用

該系統(tǒng)被理想化和開發(fā)以消除光學(xué)邊緣檢測和分割方法的局限性，例如在成人 CM 的采集過程中對適當(dāng)?shù)募?xì)胞對齊和細(xì)胞旋轉(zhuǎn)的要求（Delbridge 和 Roos，1997 年；Ren 和 Wold ， 2001年） . 為了測試我們方法的有效性和敏感性，我們將細(xì)胞暴露于對收縮參數(shù)有明確影響的藥物。成人 CM 接受異丙腎上腺素 (ISO) (100 nmol L -1 ) 或維拉帕米(VERA) (100 nmol L -1). 異丙腎上腺素是一種 β-腎上腺素能激動劑，通過增加平均速度和縮短長度的程度顯著增強(qiáng) CM 收縮力，從而減少收縮和松弛所需的時間（Butler 等人，2015 年；Harmer 等人，2012年）。維拉帕米是一種鈣通道阻滯劑，廣泛用于治療心律失常（Bourgonje 等人，2013 年），同時也是一種抗高血壓藥，因?yàn)樗谛呐K系統(tǒng)中具有負(fù)性肌力和變時作用（Harmer 等人，2012 年；斯特恩等人，1986 年）。圖 4Ai-ii 分別顯示了樣本空間圖像和平均速度軌跡，這些記錄是從以 1 Hz 刺激并用異丙腎上腺素或維拉帕米處理 60 秒的細(xì)胞記錄的。圖 4 Aiii 顯示了從一個收縮-松弛周期獲得的一條平均速度軌跡的放大視圖。圖 4 B–4D顯示了來自三個立實(shí)驗(yàn)的異丙腎上腺素和維拉帕米對成人 CM 收縮參數(shù)影響的濃度響應(yīng)分析。如圖4 B所示，ISO 和 VERA 都減少了收縮和松弛時間，對松弛時間的影響更顯著。此外，ISO 增加了大收縮和松弛速度（圖 4 C）并縮短了面積（圖 4D) 成人 CM 的濃度依賴性方式。當(dāng)用 VERA 處理細(xì)胞時，觀察到相反的效果（圖 4C和 4D）。表 S1列出了用不同濃度的 ISO 和 VERA 處理的成人 CM 獲得的所有收縮參數(shù)。值得注意的是，數(shù)據(jù)分析不需要用戶操作圖像，因?yàn)檐浖梢蕴幚韺?shí)驗(yàn)生成的整個圖像。

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圖 4。小鼠和 TGR-mREN2-27 大鼠成人 CM 收縮效應(yīng)的收縮波運(yùn)動和圖形檢測

(A) (i) 在大收縮速度 (MCS) 和大松弛速度 (MRS) 響應(yīng)異丙腎上腺素 (100 nmol L ?1 ) 期間，成年小鼠 CM 細(xì)胞位移速度顯示在幅度和矢量場中，具有視覺和數(shù)字強(qiáng)度標(biāo)度檢測或維拉帕米（100 nmol L -1）治療。比例尺，20 微米。(ii) 從以 1 赫茲刺激收縮的 CM 記錄的平均速度圖。(iii) 在異丙腎上腺素或維拉帕米治療對 CM 的影響下獲得了一個單一的收縮-松弛周期。

(B) 用 ISO 和 VERA 進(jìn)行急性處理會導(dǎo)致 CM 的所有時間參數(shù)顯著降低。

(C–E) (C) 用 VERA 處理的細(xì)胞表現(xiàn)出 MCS 和 MRS 的減少，而 ISO 誘導(dǎo)這些參數(shù)顯著增加。ISO 和 VERA 對縮短面積 (D) 和縮短分?jǐn)?shù) (E) 產(chǎn)生相反的影響。

(F) (i) 在 MCS 和 MRS 期間，SD 和 mREN 細(xì)胞位移速度顯示在幅度和矢量場中，具有視覺和數(shù)字強(qiáng)度尺度檢測。比例尺，20 微米。(ii) 在一個收縮-松弛周期中 SD 和 mREN 細(xì)胞的圖形比較。(iii)–(iv) SD 和 mREN CM 顯示相似的 MCS 和 MRS。(v)–(vi) 與 SD 相比，mREN 細(xì)胞的收縮和松弛時間有所增加。對于每個細(xì)胞，我們分析了至少 10 個事件（每個事件對應(yīng)一個收縮-松弛周期），結(jié)果代表這些事件的平均值。結(jié)果表示為來自每個實(shí)驗(yàn)組的平均 30 個細(xì)胞的平均值±SE。?p < 0.05, ??p < 0.01, ???p < 0.001, ???p < 0.0001 與對照相比。

該系統(tǒng) 的另一個特點(diǎn)是可以獲取成人 CM 細(xì)胞長度的縮短百分比。在 Motion Visualization 的窗口中（Advanced > Export cell length data— Methods S1：User Manual— section 7.4 Figure 70），用戶可以打開一個新窗口來測量細(xì)胞長度的縮短百分比（圖 S3）。該窗口顯示波選擇框，其中包含先前選擇的收縮-松弛波（圖 S3 A上的藍(lán)色條，左側(cè)）及其各自的圖形（圖 S3 A，右側(cè)）。該系統(tǒng) 使用細(xì)胞分割過程來獲取細(xì)胞邊界長度并應(yīng)用過濾器來找到細(xì)胞的佳分割（圖 S3B). 數(shù)據(jù)可以可視化并實(shí)時繪制圖表（圖 S3 C）。然后，可以導(dǎo)出分析的波形數(shù)據(jù)。為了驗(yàn)證我們的分割方法，我們通過使用經(jīng)異丙腎上腺素和維拉帕米處理或未處理的成人 CM 進(jìn)行了縮短細(xì)胞長度百分比分析。如圖 4 E所示，ISO 增加了成人 CM 細(xì)胞長度的縮短百分比，而 VERA 減少了它。綜上所述，我們的數(shù)據(jù)表明，該系統(tǒng) 可以可靠、高效地處理和分析來自成人 CM 的數(shù)據(jù)，檢測藥物作用下收縮參數(shù)的差異。例如，這種敏感性允許研究可能具有心臟保護(hù)作用的藥物，以及與現(xiàn)有心臟病相關(guān)的變化。

該系統(tǒng) 在大鼠高血壓模型中的適用性

收縮力缺陷是高血壓動物模型的一個共同特征（Jesus 等人，2020 年；Kovács 等人，2016 年）。在這里，我們使用了一種充分表征的高血壓大鼠模型，該模型由腎外組織中腎素的基因過度表達(dá)引起，即 TGR (mREN2)27 大鼠（Langheinrich，1996 年；Mullins 等人，1990 年）。mREN CM 的一個重要特征是細(xì)胞面積增加，這是心肌肥大的特征（Jesus 等人，2020 年）). 鑒于 該系統(tǒng) 獲取幅度速度的平均值，比較的單元格之間的大小差異越大，獲取可能存在的差異的靈敏度就越低。因此，與 Sprague-Dawley (SD) 大鼠肌細(xì)胞相比，測量肥大 mREN 肌細(xì)胞的數(shù)據(jù)時可能會出現(xiàn)問題。為了避免這個問題，我們通過使用新的過濾器（幅度閾值）實(shí)現(xiàn)了一個管道（有關(guān)詳細(xì)信息，請參見方法 S1：用戶手冊—— 7.3 節(jié)，幅度閾值過濾器）。

圖 4 Fi–ii 顯示了帶有運(yùn)動矢量的 CM 圖像以及 SD 和 mREN 肌細(xì)胞的平均速度軌跡的比較。如圖 4 Fiii–iv所示，SD 和 mREN 肌細(xì)胞之間的大收縮或舒張速度沒有差異。另一方面，與 SD 細(xì)胞相比，該系統(tǒng) 檢測到 mREN 肌細(xì)胞的收縮和舒張時間顯著增加（圖 4 Fv-vi）。收縮參數(shù)詳見表S2。這些結(jié)果通過更詳細(xì)地顯示通過矢量場的細(xì)胞運(yùn)動以及整個細(xì)胞，擴(kuò)展了先前的發(fā)現(xiàn)（ Jesus 等人，2020 年）。

新生兒 CM 培養(yǎng)和 hiPSC-CM 中的 該系統(tǒng) 驗(yàn)證

來自不同發(fā)育階段的心肌細(xì)胞顯示出功能和結(jié)構(gòu)差異。該系統(tǒng) 旨在獲取 CM 在不同成熟和細(xì)胞發(fā)育階段的多個實(shí)驗(yàn)條件下的收縮參數(shù)。hiPSC-CM 和新生兒-CM 是未成熟細(xì)胞，與成年心室肌細(xì)胞相比表現(xiàn)出明顯的形態(tài)和結(jié)構(gòu)組織特征（Bedada 等人，2016 年；Khan 等人，2015 年；Li 等人，2017 年；Rohr 等人， 1991). 這種結(jié)構(gòu)上的不成熟會影響 CM 的收縮性，它比成人 CM 的強(qiáng)度要低得多，并對其采集和分析提出了挑戰(zhàn)。此外，hiPSC-CM 和新生兒 CM 會自組織成合胞體并表現(xiàn)出自發(fā)收縮（Bedada 等人，2016 年；Li 等人，2017 年）。

HiPSC-CM 已通過不同的技術(shù)進(jìn)行探索，以獲得收縮和松弛的細(xì)胞動力學(xué)（Czirok 等人，2017 年；Huebsch 等人，2015 年；Maddah 等人，2015 年；Pointon 等人，2017 年）。然而，它們在研究和臨床中心作為常規(guī)應(yīng)用仍然是一個挑戰(zhàn)，要么是由于實(shí)施困難，要么是因?yàn)槿匀蝗鄙倬哂袕?qiáng)大處理能力的工具以及為非專業(yè)觀眾設(shè)計的界面。該系統(tǒng) 提供了一種可靠、快速且易于訪問的方法來處理和分析這些細(xì)胞類型的收縮動力學(xué)，從圖像到終結(jié)果集。

使用 該系統(tǒng)，我們確定了 hiPSC-CM（圖 5和S4）和新生兒 CM（圖 6 ）在基礎(chǔ)控制條件下以及與 ISO 和 VERA 孵育后的收縮和松弛周期的平均速度。圖 5 A 顯示了檢測所有 hiPSC-CM 合胞體運(yùn)動的示例空間圖像，它允許用戶從多個收縮-松弛周期中提取平均速度軌跡（圖 5 B）。為了在單波水平上更好地了解 ISO 和 VERA 治療，圖 5繪制了每個特定波的圖表C. ISO 和 VERA 對 hiPSC-CM 的影響也以濃度依賴的方式發(fā)生，并且在速度依賴參數(shù)（圖 S4 A）和平均縮短面積（圖 S4 B）上顯示出相反的結(jié)果，正如我們對這些藥物的預(yù)期. 正如先前在文獻(xiàn)中報道的那樣（Hayakawa 等人，2014 年），在使用 ISO 和 VERA 治療后觀察到收縮和舒張時間的相當(dāng)減少（圖 S4 C）。此外，ISO 和 VERA 增加了 hiPSC-CM 的跳動頻率（圖 S4 D）?？偠灾@些結(jié)果證實(shí)了我們系統(tǒng)的多功能性，為用戶提供了獲得視覺和定量評估的可能性通過微妙的修改不同的收縮細(xì)胞類型。

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圖 5。異丙腎上腺素和維拉帕米在 hiPSC-CM 收縮力中的收縮波運(yùn)動和圖形檢測

(A) 從用異丙腎上腺素 (100 nmol L -1 ) 或維拉帕米 (100 nmol L -1 ) 處理的細(xì)胞獲得的視覺和數(shù)值強(qiáng)度標(biāo)度檢測中的 hiPSC-CM 大位移速度。比例尺，50 微米。

(B) 異丙腎上腺素或維拉帕米治療平均速度的圖形檢測。

(C) 比較一個收縮-松弛周期中藥物引起的變化。MCS，大收縮速度；MRS，大弛豫速度。另請參見圖S4。

同樣，圖 6 A 顯示該系統(tǒng)通過膜位移和運(yùn)動矢量的生成，有效檢測 ISO 和 VERA 新生兒 CM 治療組的細(xì)胞收縮力差異（圖 6 Ai-iii ）。此外，分析表明，ISO 和 VERA 均以濃度依賴性方式顯著減少新生兒 CM 的收縮和松弛時間（圖6 B）。正如對這些藥物所預(yù)期的那樣，用 ISO 治療會導(dǎo)致速度相關(guān)參數(shù)（圖 6 C）和 CM 縮短區(qū)域（圖 6D)，而 VERA 處理的細(xì)胞觀察到減少。此外，該系統(tǒng)檢測了接受藥物治療或未接受藥物治療的新生兒 CM 的自律。在分析新生兒 CM 的搏動頻率時，也觀察到 ISO 和 VERA 的相反結(jié)果（圖 6 E）。hiPSC-CM 和新生兒-CM 在用不同濃度的藥物治療后的收縮參數(shù)分別列于表 S3和S4中。

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圖 6。異丙腎上腺素和維拉帕米對新生兒 CM 收縮力影響的收縮波運(yùn)動和圖形檢測

(A) (i) 在從異丙腎上腺素 (100 nmol L ?1 ) 或維拉帕米 (100 nmol/L ?1 ) 治療的作用獲得的收縮-松弛周期期間，新生兒 CM 細(xì)胞在視覺和數(shù)值強(qiáng)度尺度檢測中的位移速度。比例尺，50 微米。(ii) 從異丙腎上腺素或維拉帕米治療的新生兒 CM 記錄的平均速度修改的圖形檢測。(iii) 比較一個收縮-松弛周期中藥物引起的變化。

(B) 用 ISO 和 VERA 進(jìn)行急性治療可顯著降低新生兒 CM 的收縮和舒張時間參數(shù)。

(C) 用 VERA 處理的細(xì)胞表現(xiàn)出 MCS 和 MRS 減少，而 ISO 誘導(dǎo)這些參數(shù)顯著增加。

(D) 同樣，ISO 和 VERA 對縮短區(qū)域產(chǎn)生相反的影響。

(E) 兩種處理對細(xì)胞跳動濃度-反應(yīng)曲線顯示出相反的效果。從每個細(xì)胞區(qū)域，我們分析了至少 10 個事件（每個事件對應(yīng)于收縮-松弛周期），結(jié)果代表這些事件在 ISO 和 VERA 存在或不存在的情況下的平均值。結(jié)果表示為來自每個實(shí)驗(yàn)組的 20 個細(xì)胞區(qū)域的平均值±SE。?p < 0.05, ??p < 0.01, ???p < 0.001, ???p < 0.0001 與對照相比。

為了總結(jié)我們的發(fā)現(xiàn)，表 S5比較了收縮和松弛速度的大倍數(shù)變化，以及用 ISO 或 VERA 處理的成人 CM、新生兒 CM 和 hiPSC-CM 之間的縮短面積參數(shù)。如表S5所示，與成人 CM 和新生兒 CM 相比，hiPSC-CM 在收縮和松弛速度大倍數(shù)變化方面對 ISO 的響應(yīng)較弱。這一發(fā)現(xiàn)表明，與 hiPSC-CM 相比，新生細(xì)胞的 β-腎上腺素能反應(yīng)有所改善，并表明這兩種細(xì)胞類型之間的成熟度存在差異。盡管成人 CM 和新生兒 CM 具有相似的大倍數(shù)變化值，但前者表現(xiàn)出較低的半數(shù)大有效濃度，證實(shí)了這些細(xì)胞對 ISO 的反應(yīng)更強(qiáng)。這與以下事實(shí)一致：與成人 CM 相比，hiPSC-CM 和新生兒 CM 呈現(xiàn)不成熟的 β-腎上腺素能受體信號（Jung 等人，2016 年；Slotkin 等人，1995 年）). 然而，與成人 CM 相比，新生兒 CM 和 hiPSC-CM 對 VERA 的反應(yīng)更強(qiáng)，在新生兒細(xì)胞中觀察到更明顯的抑制收縮作用。同樣，與成人 CM 相比，新生兒 CM 和 hiPSC-CM 顯示 MCS 對 VERA 的半數(shù)大抑制濃度降低。這些差異至少部分反映了未成熟細(xì)胞對肌膜 Ca 2+循環(huán)的高度依賴性和未成熟 Ca 2+釋放單元的存在（ Korhonen 等人，2009 年；Louch 等人，2015 年）?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)增強(qiáng)了我們軟件檢測細(xì)胞對不同藥物的收縮反應(yīng)差異的敏感性。