酵母雙雜交檢測實驗技術(shù)服務

　　隨著分子生物學研究尤其是人類基因組計劃的迅速發(fā)展，為適應對眾多基因或蛋白進行功能研究的發(fā)展趨勢，已出現(xiàn)了很多新技術(shù)。其中酵母雙雜交技術(shù)以其簡便，靈敏，高效以及能反映不同蛋白質(zhì)之間在活細胞內(nèi)的相互作用等特點在基因功能的研究中得到了廣泛的應用。

　　蛋白的酵母雙雜交實驗是以酵母的遺傳分析為基礎，研究反式作用因子之間的相互作用對真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響的實驗，同以往研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間相互作用的實驗手段相比，酵母雙雜交系統(tǒng)具有其*優(yōu)勢。

1、融合體蛋白之間的相互作用是在真核酵母細胞內(nèi)進行，蛋白質(zhì)保持天然的折疊狀態(tài)，這是其他離體生化檢驗方法所缺乏的，它所證實的蛋白質(zhì)間相互作用將更接近于體內(nèi)的真實水平。
2、雙雜交系統(tǒng)的敏感度非常高，蛋白質(zhì)之間結(jié)合常數(shù)低至1mmol/L時都可以被偵測。
3、在篩選cDNA 文庫時，雙雜交系統(tǒng)能夠簡捷地得到編碼相互作用蛋白的基因序列，它只需構(gòu)建質(zhì)粒而不必準備抗體或純化蛋白，省略了其它體外檢測蛋白之間相互作用方法所必須的蛋白抽提、純化等繁瑣步驟。

酵母雙雜交實驗原理：

　　以Gal4系統(tǒng)為例，BD和AD分別由Gal4蛋白上不同的兩個結(jié)構(gòu)域(1-147aa與768-881aa)構(gòu)成。在利用GAL4系統(tǒng)篩選cDNA文庫或研究蛋白間的相互作用時，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶蛋白即"誘餌"相結(jié)合，轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域與文庫蛋白或要驗證的蛋白相結(jié)合。一般情況下，單獨的BD可以與GAL4上游活化序列（GAL UAS）結(jié)合但不能引起轉(zhuǎn)錄，單獨的AD則不能與GAL UAS結(jié)合；只有當BD與AD分別表達的融合蛋白由于相互作用而導致兩者在空間上相互靠近時，BD與AD才能與GAL UAS結(jié)合并且引起報道基因的轉(zhuǎn)錄，從而激活下游報告基因，通過這一系列實驗來驗證兩個蛋白之間的相互作用。

★ 酵母單/雙雜交檢測服務項目列表

服務一、酵母單雜交文庫構(gòu)建服務

　　酵母單雜交體系能在一個簡單實驗過程中，識別與DNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，同時可直接從基因文庫中找到編碼蛋白的DNA序列，而無需分離純化蛋白，實驗簡單易行。為了獲得良好的酵母單雜交篩選實驗結(jié)果，構(gòu)建酵母單雜的文庫至關(guān)重要，我們可以依據(jù)不同的實驗需要及物種特性，選擇不同的體系建庫方法，我們的技術(shù)專家可以熟練的應用Clonetech的SAMRT方法和life的gateway方法建立，同時，我們的技術(shù)專家也開發(fā)出了基于同源重組原理的建庫方法。

★ 酵母單雜交文庫構(gòu)建實驗流程： 
 1. RNA提取 
 2. mRNA提取 
 3. cDNA的酶促法合成
 4. cDNA連接接頭 
 5. cDNA按長度分離 
 6. cDNA與酵母單雜交文庫載體pGADT7進行all-direct重組 
 7. 重組產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化 
 8. 文庫檢測以及質(zhì)粒提取

★ 酵母單雜交文庫構(gòu)建實驗材料要求： 

客戶構(gòu)建的酵母單雜交cDNA文庫，由客戶提供組織、細胞或總RNA給我們即可：

細胞樣本：細胞數(shù)量大于1*10^7；

動物樣本：大于1g；

植物樣本：大于2g；

總RNA：大于200ug。

★ 產(chǎn)品質(zhì)量標準：

 原始文庫庫容量大于1*10^7CFU；
 平均插入片段大于1000bp ；
 克隆陽性率大于95%。

服務二、酵母單雜交文庫篩選技術(shù)服務

在研究DNA—蛋白質(zhì)相互作用中，酵母單雜交體系主要有以下3種用途：

①確定已知DNA—蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用；②分離結(jié)合于目的順式調(diào)控元件或其他短DNA結(jié)合位點蛋白的新基因；③定位已經(jīng)證實的具有相互作用的DNA結(jié)合蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及準確定位與DNA結(jié)合的核苷酸序列。

客戶僅提供用于篩選的誘餌質(zhì)粒信息，我們完成雜交篩選相關(guān)工作：
 1. 誘餌載體的構(gòu)建
 2. 誘餌質(zhì)粒的自激活檢測
 3. 文庫質(zhì)粒和誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)酵母感受態(tài)細胞
 4. 文庫篩選和3AT優(yōu)化
 5. 文庫篩選結(jié)果測序分析
 6. 篩選結(jié)果回轉(zhuǎn)驗證
 7. 詳細報告的整理和數(shù)據(jù)發(fā)送

試驗完成后提供完整的實驗報告，包含實驗原始圖片，陽性克隆，測序鑒定結(jié)果，質(zhì)粒及菌株等。

服務三、核蛋白體系酵母雙雜交文庫篩選技術(shù)服務

　　艾柏森生物的核蛋白體系酵母雙雜交服務可以選擇使用life的pDEST22和clonetech的pGADT7兩套系統(tǒng)進行篩選，篩選文庫可以使用預制商業(yè)化文庫或者本公司定制構(gòu)建的酵母雜交文庫。 
　 需要指出的是，融合體蛋白必須轉(zhuǎn)運至核內(nèi)才能活化轉(zhuǎn)錄，因此對于胞外配體-受體作用以及需要核外修飾或受磷酸化等翻譯后修飾過程介導的蛋白質(zhì)間相互作用而言，該系統(tǒng)的應用受到一些限制。在進行文庫篩選時，假陽性結(jié)果常常干擾實驗的準確性，除某些文庫編碼的蛋白質(zhì)本身含有轉(zhuǎn)錄活化成分外，細胞內(nèi)的其它無關(guān)蛋白也可能有類似作用，因此雙雜交系統(tǒng)檢測的結(jié)果必須通過其它蛋白間相互作用的實驗來進一步驗證。

客戶只需提供用于篩選的誘餌質(zhì)粒信息，我們完成雜交篩選相關(guān)工作：

 1. 誘餌載體的構(gòu)建
 2. 誘餌質(zhì)粒的自激活檢測
 3. 文庫質(zhì)粒和誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)酵母感受態(tài)細胞
 4. 文庫篩選和3AT優(yōu)化
 5. 文庫篩選結(jié)果測序分析
 6. 篩選結(jié)果回轉(zhuǎn)驗證
 7. 詳細報告的整理和數(shù)據(jù)發(fā)送

服務四、膜蛋白體系酵母雙雜交文庫篩選技術(shù)服務

　　該系統(tǒng)的原理是利用連接有泛素(ubiquitin)的蛋白能夠被泛素特異性的蛋白酶(UBPs)識別并切割下泛素，而這種特異性切割只在泛素能夠正確折疊的前提下發(fā)生。在正常情況下，泛素斷裂成兩部分后在體內(nèi)能自發(fā)結(jié)合成可被 UBPs識別的重構(gòu)泛素，而當有突變發(fā)生時，即泛素的N端發(fā)生Ile13/Gly13的突變,這種斷裂泛素的重構(gòu)就無法進行。 只有當與斷裂的泛素的兩部分分別連接一個蛋白，且兩個蛋白之間存在相互作用,斷裂泛素的重組又得以恢復。斷裂泛素重組的發(fā)生能將連接在泛素C端的轉(zhuǎn)錄因子切割并進入細胞核內(nèi)激活報告基因的轉(zhuǎn)錄表達，通過報告基因是否表達,可以檢測兩個蛋白之間是否存在相互作用

　　基于分離的泛素(split-ubiquitin)介導的膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)，區(qū)別于傳統(tǒng)的核蛋白互作分析，可用于研究膜蛋白間及膜蛋白與胞質(zhì)蛋白間的互作。在酵母細胞中，泛素可以分成兩部分表達，即其N端部分(NubI)和C端部分(Cub)，后者融合有能啟動核內(nèi)報告基因表達的LexA蛋白。NubI和Cub-LexA在細胞中組成可分離的泛素蛋白體系

客戶只需提供用于篩選的誘餌質(zhì)粒信息，我們完成雜交篩選相關(guān)工作：
1. 誘餌載體的構(gòu)建
2. 誘餌質(zhì)粒的自激活檢測
3. 文庫質(zhì)粒和誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)酵母感受態(tài)細胞
4. 文庫篩選和3AT優(yōu)化
5. 文庫篩選結(jié)果測序分析
6. 篩選結(jié)果回轉(zhuǎn)驗證
7. 詳細報告的整理和數(shù)據(jù)發(fā)送

客戶案例1——

★　酵母雜交文庫構(gòu)建服務案例（限于篇幅，我們只選取了實驗報告中部分步驟，如果需要了解更多的實驗信息，請聯(lián)系客服人員）

一、試劑、耗材（略）
二、儀器設備（略）
三、試劑及配制 （略）
四、酵母雜交文庫構(gòu)建實驗流程
1、Trizol法RNA的提取
2、使用Oligotex mRNA Kits（Qiagen）分離純化樣本的mRNA，mRNA質(zhì)量可以滿足文庫要求，mRNA總量為6.9 ug 
3、酵母雙雜交文庫構(gòu)建
3.1、di一鏈cDNA合成
3.2、cDNA第二鏈的合成
3.3、加5’接頭(3個讀碼框，每個讀碼框連接一份，共3份)
3.4、cDNA長度分離, 使用低熔點瓊脂糖電泳cDNA，切膠回收1 Kbp以上的條帶，乙醇沉淀后溶于14 ul水中。
3.5、使用Infusion重組反應體系連接cDNA與載體pGADT7
3.6、電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞
4、酵母雙雜交文庫的構(gòu)建質(zhì)量鑒定
4.1、庫容量的鑒定
取轉(zhuǎn)化后細菌原液10 uL稀釋100倍后，從中取出10 uL涂布LB平板（含氨芐抗性），第二天計數(shù)。
CFU/mL=平板上的克隆數(shù)/10 uL×100倍×1×103 uL
文庫總CFU= CFU/mL×文庫菌液總體積（mL）
4.2、插入片段大小鑒定
從轉(zhuǎn)化平板上隨機挑取24個單克隆菌落，經(jīng)PCR擴增后，用電泳檢測PCR產(chǎn)物大小。

五、文庫擴增及質(zhì)粒提取
將轉(zhuǎn)化后原始文庫菌液涂布氨芐抗性培養(yǎng)基平板擴增培養(yǎng)，第二天用液體培養(yǎng)基從平板上洗脫菌苔，取其中2/3體積用Qiagen大抽試劑盒抽提質(zhì)粒DNA，剩余1/3體積中加入25%無菌甘油混合均勻后灌裝保種管，凍存于-80℃冰箱。
六、文庫菌保存和文庫篩選
凍存于-80℃冰箱內(nèi)，可以保存2年以上，文庫質(zhì)粒可以直接用于酵母文庫篩選，pGADT7 酵母雙雜交文庫菌的抗性為氨芐抗性（50 ug/mL）

備注：
 1. 文庫構(gòu)建使用的引物序列，雙雜交文庫擴增檢測引物：
 F：5′-TAATACGACTCACTATAGGGCGAGCGCCGCCATG-3′
 R：5′-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3′  
如果需要對文庫中的克隆質(zhì)粒進行測序，請使用以下引物：
 T7：TAATACGACTCACTATAGGGC
 ADR：GTGAACTTGCGGGGTTTTTC

客戶案例2——

★ 酵母雙雜交文庫篩選ORF1的相互作用蛋白服務案例

一、試劑、耗材（略）儀器設備（略）試劑及配制（略）
二、誘餌載體構(gòu)建pGBKT7- ORF1的構(gòu)建與鑒定（此步驟為常規(guī)的實驗方法，可以通過酶切、測序等方法鑒定酵母雜交誘餌載體正確性，此處略）
三、ORF1自激活檢測
1、酵母轉(zhuǎn)化反應
將各種質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體菌AH109中，觀察檢測結(jié)果。

2、酵母轉(zhuǎn)化方法
 1. 從YPDA平板挑取AH109單菌落接種于YPDA液體培養(yǎng)基4 ml，30℃，225 rpm，振蕩培養(yǎng)18-20 h（過夜），至OD600>1.5，一般為4左右。
 2. 轉(zhuǎn)接YPDA液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)體積為50 ml，使初始OD600=0.2，30℃，225 rpm，振蕩培養(yǎng)4-5h，至OD600=0.6。
 3. 離心收菌，室溫，4000 rpm，5 min。
 4. 用20 ml無菌水重懸菌體，混勻，離心收菌，室溫，4000 rpm，5 min，棄上清。
 5. 用5 ml 0.1 M LiAc重懸菌體，混勻，離心收菌，室溫，4000 rpm，5 min，棄上清。
 6. 用500 ul 0.1 M LiAc重懸菌體，混勻，分裝至1.5 ml離心管，每個50 ul（每個轉(zhuǎn)化），備用。
 7. 每個1.5 ml離心管中依次加入相應試劑，用槍頭吹打混勻，或劇烈振蕩1 min左右，至*混勻。
 8. 30℃水浴孵育，30 min。
 9. 42℃水浴熱激，25 min。
 10. 30℃水浴復蘇，30 min。
 11. 離心收菌，室溫，4000 rpm，5 min，棄上清。
 12. 每個轉(zhuǎn)化用200 ul無菌水懸浮菌體，盡量溫和地混勻，涂布相應的缺陷型篩選平板。
 13. 30℃恒溫培養(yǎng)4天。
3、ORF1自激活檢測結(jié)果
pGBKT7-ORF1 + pGADT7共轉(zhuǎn)化AH109長出的酵母轉(zhuǎn)化子隨機挑取了6個菌落進行自激活檢測。包括HIS3、ADE2和LacZ共3個報告基因的檢測。
HIS3和ADE2的檢測采用點板培養(yǎng)的方法，將轉(zhuǎn)化子點板至SD-TLHA平板，30℃恒溫培養(yǎng)4天，觀察其生長狀態(tài)。
LacZ報告基因的檢測方法如下：
 1. 從轉(zhuǎn)化平板隨機挑取6個菌落于濾紙片上。
 2. 將濾紙*浸于液氮中90 s，取出常溫放置2 min晾干。
 3. 在培養(yǎng)皿中加入新鮮配制的顯色液，一般9 cm培養(yǎng)皿用2-3 ml顯色液。
4、將顯色液加入培養(yǎng)皿中，再放入一張干凈的濾紙，讓其*浸濕，將凍溶后的濾紙放在上面，使顯色液浸透表層，蓋上皿蓋。30℃避光培養(yǎng)，20 min后開始觀察，一般2 h后可開始看到顏色變化。4-5h拍照記錄結(jié)果。

對照菌株在SD-TL缺陷平板上都能正常生長，而僅有陽性對照可在SD-TLHA缺陷平板生長。pGBKT7-ORF1  +pGADT7轉(zhuǎn)化子中隨機挑選的6個菌落在SD-TLHA缺陷平板上不能生長，生長狀態(tài)同陰性對照，LacZ檢測中結(jié)果也與陰性對照相同，因此不存在自激活。

自激活檢測結(jié)論：ORF1誘餌克隆沒有自激活作用。

四、文庫篩選 
用含有正確pGBKT7-ORF1誘餌質(zhì)粒的AH109酵母轉(zhuǎn)化子作為受體菌制備感受態(tài)，將文庫質(zhì)粒pGADT7-酵母雙雜-cDNA轉(zhuǎn)入其中，涂SD-Trp-Leu-His+  5 mM 3AT平板。

五、影印清除
為了消除背景生長菌落的干擾，在培養(yǎng)到第3天時，用絨布對篩庫平板進行影印清除后，繼續(xù)培養(yǎng)7-14天。分批挑取再次長出的轉(zhuǎn)化子菌落進行下一步檢測。

六、陽性克隆鑒定
至影印清除后繼續(xù)培養(yǎng)7-14天，從篩庫平板中挑取長出的陽性克隆單菌落，共挑取到20個初始陽性克隆轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到SD-TL缺陷型平板中繼續(xù)培養(yǎng)2-3天。
1.　陽性克隆His和Ade報告基因的檢測 
將上述SD-TL缺陷型平板上長出的20個初始陽性克隆轉(zhuǎn)化子分別用無菌水稀釋后點種至SD-TL和SD-TLHA缺陷平板，30℃恒溫培養(yǎng)3-4天。

陽性克隆檢測結(jié)果顯示：在20個初始陽性克隆中，有13個能在SD-TLHA生長的是激活了ADE2和HIS3報告基因。

2.　陽性克隆LacZ報告基因檢測
將20個初始陽性克隆用無菌水重懸后點于濾紙片上進行LacZ報告基因檢測。結(jié)果如下圖所示：

七、酵母陽性克隆DNA提取和測序比對

通過測序比對，可以將重復的陽性給克隆子去除，本實驗案例中，有多個克隆子為重復的陽性克隆，經(jīng)過篩除后，我們可以確認獲得了6個*不同的陽性克隆子。

八、回轉(zhuǎn)驗證
用含有正確pGBKT7-ORF1誘餌質(zhì)粒的AH109酵母轉(zhuǎn)化子作為受體菌制備感受態(tài)，將6種陽性克隆質(zhì)粒DNA分別轉(zhuǎn)化其中，分別回轉(zhuǎn)驗證His和Ade報告基因的檢測和LacZ報告基因檢測。

實驗結(jié)論：

本項目以ORF1基因cDNA克隆為誘餌，篩選cDNA酵母雙雜交文庫，在篩選到的20個初始陽性中，經(jīng)過鑒定結(jié)果顯示有13個能激活ADE2、HIS3和LacZ報告基因。經(jīng)過對這些陽性克隆質(zhì)粒進行DNA測序和BLAST比對分析，結(jié)果表明它們分別屬于6種不同蛋白的編碼基因。

通過對這6種陽性克隆的回轉(zhuǎn)驗證檢測，結(jié)果顯示所有陽性克隆都能通過對ADE2、HIS3和LacZ報告基因的回轉(zhuǎn)驗證。