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二手PCR儀每個(gè)循環(huán)包括哪三個(gè)關(guān)鍵步驟
閱讀：967 發(fā)布時(shí)間：2022-4-26
二手PCR儀是一種核酸檢測和定量分析的新方法，可以作為傳統(tǒng)實(shí)時(shí)定量PCR的替代方法，以實(shí)現(xiàn)一致定量及稀有等位基因的檢測。數(shù)字PCR的工作原理在于將DNA或cDNA樣品分割為許多單獨(dú)、平行的PCR反應(yīng)，部分這些反應(yīng)包含了靶標(biāo)分子(陽性)，而其他不包含(陰性)。單個(gè)分子可以被擴(kuò)增一百萬倍或更多。在擴(kuò)增期間，TaqMan化學(xué)試劑及染料標(biāo)記探針可用于檢測特定序列的靶標(biāo)。當(dāng)不存在任何靶標(biāo)序列時(shí)，沒有信號(hào)累積。PCR分析后，陰性反應(yīng)片段用于生成樣品中靶標(biāo)分子的一致計(jì)數(shù)，而無需標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)標(biāo)。
二手PCR儀每個(gè)循環(huán)包括這三個(gè)關(guān)鍵步驟。通常，它運(yùn)行40個(gè)周期。
1、幼化：雙鏈DNA通過高溫孵育“溶解”成多肽鏈，單鏈DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)松動(dòng)。一般DNA聚合酶可以承受較大的溫度(一般為95℃)。如果免費(fèi)模板的GC含量高，時(shí)間會(huì)有所提高。
2、熱處理：在整個(gè)熱處理過程中，與開放閱讀框的緊密接觸有機(jī)會(huì)引起雜交雜交。因此，解鏈溫度(TM)應(yīng)根據(jù)計(jì)算個(gè)人所得稅的引物設(shè)計(jì)，并選用合適的溫度(一般比引物設(shè)計(jì)的TM低5℃)。
3、擴(kuò)寬：70-72℃中間，DNA聚合酶活性為，引物加寬速度可達(dá)每秒100個(gè)堿基。隨即，熒光定量PCR中擴(kuò)增的精彩畫面就小了。通常，該步驟與溫度為60°C的熱處理步驟相結(jié)合。使用隨機(jī)引物設(shè)計(jì)或寡核苷酸(DT)和隨機(jī)引物設(shè)計(jì)化學(xué)品。用于cDNA轉(zhuǎn)化的溫度取決于所選的RT酶。逆轉(zhuǎn)錄后，將約10%的cDNA轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的試管中進(jìn)行及時(shí)的熒光定量PCR。