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        1. 斯戴普(北京)科技有限公司

          蛋白質(zhì)樣品、微量樣品、各類儀器樣品前處理分析方法匯總,你必須知道

          時(shí)間:2021-4-2 閱讀:1800
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          #微量樣品前處理技術(shù)

           
           
          首先必須講解的是微量樣品前處理技術(shù),畢竟微量樣品前處理更需要技巧。(主要是固相萃取技術(shù)?。?/span>
           
           針頭過濾器、超速離心是除去固體顆粒的微量樣品前處理技術(shù),而固相萃?。⊿olid-phaseextraction,SPE)和固相微萃?。⊿olid-phasemicro extraction,SPME)是兩種從各類復(fù)雜樣品中提取凈化微量待測(cè)組分的新技術(shù),它們具有分離速度快、操作簡(jiǎn)單、萃取效率高、無乳化等特點(diǎn),在環(huán)境分析、藥物分析、形態(tài)分析等方面有廣泛應(yīng)用,尤其適用色譜分析樣品前處理。
           
          分析樣品制備技術(shù):將采集樣品轉(zhuǎn)化為適合(色譜)分析測(cè)定的形態(tài)。
           
          (1)固相萃取
           
          它的優(yōu)點(diǎn)是:節(jié)省時(shí)間,交叉污染機(jī)會(huì)小,重現(xiàn)性好,回收率高,特別適用于微量試液處理。
           
          固相萃取的關(guān)鍵是根據(jù)樣品的性質(zhì)正確選擇固相萃取小柱及洗脫條件。
           
           
          (2)固相微萃取
           
          固相微萃取集“采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣”于一體,能夠與氣相色譜或高效液相色譜儀聯(lián)用樣品前處理技術(shù)。
           
          ※與SPE 相比SPME具有以下優(yōu)點(diǎn):
           
          (1)不使用有機(jī)溶劑萃取,降低了成本,避免了二次污染;
          (2)操作時(shí)間短,從萃取進(jìn)樣到分析結(jié)束不足1h;
          (3)樣品用量少,幾mL~幾十mL;
          (4)操作簡(jiǎn)便,可減少待測(cè)組分的揮發(fā)損失;   
          (5)檢測(cè)限達(dá) μg/L~ng/L水平;
          (6)適于揮發(fā)性有機(jī)物、半揮發(fā)性有機(jī)物及不具揮發(fā)性的有機(jī)物。
           
          ※固相微萃取的使用:關(guān)鍵在于“纖維頭的選擇”,這種情況類似于色譜柱的選擇,主要根據(jù)分析對(duì)象的分子量和極性。固相微處理技術(shù)適用于氣體、水樣、生物樣品(如,血、尿、體液等)的萃取提取。
           
          ※固相微萃取技術(shù)條件的選擇:
           
          纖維表面固定相
           
          固相微萃取法在農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用
           
           
           
          #蛋白質(zhì)樣品前處理
           
           
          蛋白質(zhì)的分離、純化對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究具有重要意義,蛋白質(zhì)分離技術(shù)是利用蛋白質(zhì)的特性,如,溶解度、分子質(zhì)量大小、等電點(diǎn)、吸附特性和其它離子的生物親和力等的不同,選擇合適的分離模式并建立的純化方法。常用的分離方法包括沉淀法、色譜法和電泳及毛細(xì)管電泳。
           
          幾種方法供你選擇:
           
          (1)沉淀法
           
          利用蛋白質(zhì)在溶液中的不同溶解度。蛋白質(zhì)的溶解度取決于分子中氨基酸的類型和電荷數(shù),通過改變緩沖液pH值、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)或溫度而改變蛋白質(zhì)的溶解度。主要使用的沉淀分離技術(shù)有鹽析、等電點(diǎn)沉淀、溶劑分級(jí)分離。
           
          (2)透析法
           
          利用半透膜只允許小分子透過而大分子不能透過的原理來分離溶液中的蛋白質(zhì)。通常至少需要12h。
           
          (3)超濾法
           
          采用半透膜在一定壓力下,按照分子質(zhì)量大小分離溶質(zhì)的一門技術(shù)。與透析相似,但速度快得多。
           
          蛋白質(zhì)的構(gòu)成成分:氨基酸前處理
           
          1.氨基酸的分離和檢測(cè)手段,以往用化學(xué)分析法、層析法、比色法、氣相色譜法、氨基酸自動(dòng)分析儀。
           
          2.隨著高效液相色譜及填料的發(fā)展,HPLC在氨基酸檢測(cè)方面顯示了其*的*性,但大多數(shù)氨基酸無紫外吸收和熒光發(fā)射特性,為提高分析檢測(cè)靈敏度和分離選擇特性,通常將氨基酸衍生,衍生方式有柱前衍生法與柱后衍生法。
           
          3.HPLC與各種衍生相結(jié)合的氨基酸分析技術(shù),構(gòu)成了具有廣泛適用性的現(xiàn)代氨基酸分析技術(shù)。
           
          樣品處理
           
          測(cè)定蛋白質(zhì)中的總氨基酸,必須先把蛋白質(zhì)水解成游離氨基酸。可采用酸水解、堿水解和酶水解方法,其中以酸水解法應(yīng)用泛。
           
          (1)酸水解
           
          條件:常用硫酸或鹽酸進(jìn)行水解。一般用6mol/LHCl,4mol/L H2SO4煮沸回流24小時(shí)左右。
           
          優(yōu)點(diǎn):可蒸發(fā)除去鹽酸,水解*,終產(chǎn)物為L(zhǎng)-α-氨基酸,產(chǎn)物單一,無消旋現(xiàn)象。
           
          缺點(diǎn):色氨酸破壞,絲氨酸和蘇氨酸有一小部分被水解,同時(shí)天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下來。
           
          (2)堿水解
           
          條件:分析色氨酸可采用堿水解法,一般與5mol/L NaOH煮沸10~20小時(shí)。
           
          優(yōu)點(diǎn):水解*,色氨酸不被破壞,水解液清亮。
           
          缺點(diǎn):產(chǎn)生消旋產(chǎn)物,破壞的氨基酸多。
            
          (3)酶水解
           
          某些氨基酸對(duì)酸或堿不穩(wěn)定,在酸或堿水解時(shí)易被破壞,某些蛋白質(zhì)樣品在酸或堿水解不*,影響某些氨基酸的回收率。對(duì)這些樣品可采用酶水解法。酶水解法可定量測(cè)定天東氨酸、谷氨酸和色氨酸。
           
          條件:蛋白酶,如,胰蛋白酶、糜蛋白酶,常溫37~40℃, pH值5~8 。
           
          優(yōu)點(diǎn):氨基酸不被破壞,不發(fā)生消旋現(xiàn)象。
           
          缺點(diǎn):水解不*,中間產(chǎn)物多。
           
           
          #生物樣品分析前處理技術(shù)
           
           
          問題來了:為什么要進(jìn)行前處理?
           
          存在形式多樣:游離型藥物、與蛋白質(zhì)結(jié)合型藥物、代謝物、葡萄糖醛酸苷、硫酸酯綴合物等。
           
          成分復(fù)雜:蛋白質(zhì)、糖、脂肪、尿素、Na+、K+、X-等。
           
          (1)去除蛋白質(zhì)
          釋放結(jié)合型藥物、減少提取過程中乳化、保護(hù)儀器、提高靈敏度。
          加入與水混溶的有機(jī)溶劑
          中性鹽
          強(qiáng)酸
          加入含鋅鹽、銅鹽的沉淀劑
          酶解法
            
          (2)綴合物的水解
          酸水解/酶水解
           
          (3)有機(jī)破壞
          測(cè)定生物樣品中的金屬離子,常用HNO3-HClO4作為消解劑,一般得到高價(jià)態(tài)金屬離子。
           
          (4)分離、純化和濃集
          使被測(cè)物在所用分析技術(shù)的檢測(cè)范圍內(nèi),常用萃取法:
          液-液萃取法(LLE)
          液-固萃取法(LSE)
          相當(dāng)于縮小的柱色譜法
          濃集
          末次萃取液盡量少
          揮去萃取溶劑
           
          (5)化學(xué)衍生化
          可使藥物:
          具有能被分離的性質(zhì)
          提高靈敏度
          增強(qiáng)穩(wěn)定性
          提高對(duì)光學(xué)異構(gòu)體分離的能力
           
           
          #各類儀器樣品前處理大匯總
           
           
          1.核磁共振波譜儀
           
          (1)送檢樣品純度一般應(yīng)>95%,無鐵屑、灰塵、濾紙毛等雜質(zhì)。一般有機(jī)物須提供的樣品量:1H譜>5mg,13C譜>15mg,對(duì)聚合物所需的樣品量應(yīng)適當(dāng)增加。
           
          (2)本儀器配置僅能進(jìn)行液體樣品分析,要求樣品在某種氘代溶劑中有良好的溶解性能,進(jìn)樣前應(yīng)先選好所用溶劑。常備的氘代溶劑有重水、甲醇、丙酮、DMSO、苯、鄰二氯苯、乙腈、吡啶、醋酸。
           
          (3)檢測(cè)前盡量提供樣品的可能結(jié)構(gòu)或來源。如有特殊要求(如,檢測(cè)溫度、譜寬等)請(qǐng)予以說明。
           
          2.紅外光譜儀
           
          為了保護(hù)儀器和保證樣品紅外譜圖的質(zhì)量,本儀器分析的樣品,必須做到:
           
          (1)樣品必須預(yù)先純化,以保證有足夠的純度;
           
          (2)樣品須預(yù)先除水干燥,避免損壞儀器,同時(shí)避免水峰對(duì)樣品譜圖的干擾;
           
          (3)易潮解的樣品,請(qǐng)用戶自備干燥器放置;
           
          (4)對(duì)易揮發(fā)、升華、對(duì)熱不穩(wěn)定的樣品,請(qǐng)用帶密封蓋或塞子的容器盛裝并蓋緊,同時(shí)必須在樣品分析任務(wù)單上注明;
           
          (5)對(duì)于有毒性和腐蝕性的樣品,必須用密封容器裝好。送樣時(shí)必須分別在樣品瓶標(biāo)簽的明顯位置和分析任務(wù)單上注明。
           
          3.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀
           
          氣相色譜儀均使用毛細(xì)管柱(不能使用填充柱)。進(jìn)入氣相色譜的樣品,必須在色譜柱的工作溫度范圍內(nèi)能夠*汽化。
           
          4.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀
           
          (1)易燃、易爆、毒害、腐蝕性樣品必須注明。
           
          (2)為確保分析結(jié)果準(zhǔn)確、可靠,要求樣品*溶解,不得有機(jī)械雜質(zhì);未配成溶液的樣品請(qǐng)注明溶劑,已配成溶液的樣品請(qǐng)標(biāo)明濃度。
           
          (3)請(qǐng)盡可能提供樣品的結(jié)構(gòu)式、分子量或所含官能團(tuán),以便選擇電離方式;如有特殊要求者,請(qǐng)?zhí)峁┚唧w實(shí)驗(yàn)條件。
           
          (4)液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用時(shí),所有緩沖體系一律用易揮發(fā)性緩沖劑,如乙酸、醋酸銨、氫氧化四丁基銨等配成。凡要求定量分析者請(qǐng)?zhí)峁?biāo)準(zhǔn)對(duì)照品。
           
          5.飛行時(shí)間質(zhì)譜儀
           
          (1)試樣的種類、組分及樣品量
           
          本儀器擅長(zhǎng)測(cè)定多肽、蛋白質(zhì),也可以測(cè)定其它生物大分子如多糖、核酸和高分子聚合物、合成寡聚物以及一些相對(duì)分子質(zhì)量較小的有機(jī)物,如,C60或C60的接枝物等。被測(cè)樣品可以是單一組分也可以是多組分的,但樣品組分越多,譜圖就越復(fù)雜,譜圖分析的難度也越大;如果電離過程中組分之間存在相互抑制作用,則不一定能保證每個(gè)組分都出峰,常規(guī)測(cè)定的樣品量約為1-10皮摩爾/微升。
           
          (2)樣品的溶解性
           
          被測(cè)樣品必須能夠溶于適當(dāng)?shù)娜軇?/span>未溶解的固體或純液體。若樣品為溶液,則應(yīng)提供樣品的溶劑、濃度或含量等信息。
           
          (3)純度
           
          為取得高質(zhì)量的質(zhì)譜圖,多肽和蛋白質(zhì)樣品應(yīng)避免含氯化鈉、氯化鈣、磷酸氫鉀、二甲亞砜、尿素、甘油、吐溫、十二烷基硫酸鈉等。如果被測(cè)樣品在預(yù)處理過程中不能避免使用上述試劑,則必須用透析法和高效液相色譜法對(duì)樣品進(jìn)行純化。水、碳酸氫銨、醋酸銨、甲酸銨、乙腈等都是用于純化樣品的合適試劑。蛋白質(zhì)樣品純化后,應(yīng)盡可能凍干。樣品中的鹽可通過離子交換法去除。
           
          6.紫外-可見吸收光譜儀
           
          (1)樣品溶液的濃度必須適當(dāng),且必須清澈透明,不能有氣泡或懸浮物質(zhì)存在;
           
          (2)固體樣品量>0.2g,液體樣品量>2mL?!?/span>
           
          7.氣相色譜儀
           
          能直接分析的樣品應(yīng)是可揮發(fā)、且是熱穩(wěn)定的,沸點(diǎn)一般不超過300℃,不能直接進(jìn)樣的,需經(jīng)前處理。
           
          8.液相色譜儀
           
          樣品要干燥,能提供要檢測(cè)組份的結(jié)構(gòu);對(duì)于復(fù)雜樣品,盡可能提供樣品中可能還有其它哪些成分。
           
          9.元素分析儀
           
          (1)填寫元素分析送樣登記表,盡可能提供分子式和元素的理論含量或其它相關(guān)信息;
           
          (2)樣品必須是不含吸附水的均勻固體微?;蛞后w,并經(jīng)過提純。如,樣品不純(含吸附水、有機(jī)溶劑、無機(jī)鹽或其它雜質(zhì))會(huì)影響分析結(jié)果,使測(cè)試值與計(jì)算值不符;
           
          (3)樣品應(yīng)有足夠的量,以滿足方法和儀器的線性和靈敏度。
           
          10.離子色譜儀
           
          送檢樣品可以溶于水,或稀酸、稀堿,所用的酸堿不能含有待測(cè)離子。對(duì)于樣品中含有待測(cè)元素,但在水、酸、堿溶液中以非離子狀態(tài)存在的化合物,需要進(jìn)行相應(yīng)的樣品前處理。
           
          11.等離子體原子發(fā)射光譜儀
           
          (1)對(duì)送檢樣品(檢測(cè)條件)的要求:
           
          ①請(qǐng)告知樣品來源、種類、屬性(如,礦石、合金、硅酸鹽、特種固熔體、高聚物等)。
           
          盡可能列出主要成份、雜質(zhì)成份及其(估計(jì))含量;待檢元素中含量是多少?對(duì)于溶液,請(qǐng)寫明介質(zhì)成份(溶劑、酸堿的種類及其(估計(jì))含量)、 含氟( F-)與否?因?yàn)榉‵-)將嚴(yán)重腐蝕霧化器!
           
          ②固體樣品要制成不含任何有機(jī)物的溶液,其最終酸度控制為1mol,樣品量:5-50mL 。如,含懸浮物或沉淀,需要;另請(qǐng)同時(shí)送上試劑空白溶液用作扣除空白,此項(xiàng)不收費(fèi)!
           
          ③樣品要求處理成溶液以后才送至測(cè)試中心。
           
          (2)由于條件限制,本室無法分析下列元素和某些物質(zhì):
           
          ①樣品加熱、加酸溶解時(shí)易揮發(fā)損失者(如,B,Hg,S-2,Se及用HF溶樣時(shí)的Si);
           
          ②陶瓷、玻璃類及其它用無機(jī)酸不能溶解、只可用堿融熔者;
           
          ③有機(jī)硅、硅橡膠、塑料制品、纖維類或任何在500℃以內(nèi)灰化、及其后的酸消解中:
          A.易揮發(fā)損失者;
          B.無法灰化或無法溶解者(如,B,Bi,Ge,Hg,Os,Ru,Sb,Se,Sn,Tl及用HF溶樣時(shí)的Si;特種固熔體、高聚物等。
           
          12.原子熒光光譜儀
           
          (1)樣品分析一般要求
           
          原子熒光光譜儀分析的對(duì)象是以離子態(tài)存在的砷(As)、硒(Se)、鍺(Ge)、碲(Te)等及汞(Hg)原子,樣品必須是水溶液或能溶于酸。
           
          (2)固體樣品
           
          ①無機(jī)固體樣品:樣品經(jīng)簡(jiǎn)單溶解后保持適當(dāng)酸度。
           
          檢測(cè)砷(As)、硒(Se)、碲(Te)、汞(Hg),介質(zhì)為鹽酸(5% ,v/v);
          檢測(cè)鍺(Ge),介質(zhì)為硫酸(5%,v/v);
           
          檢測(cè)汞(Hg),介質(zhì)也可為硝酸(5%,v/v),檢測(cè)(As)介質(zhì)也可為硫酸(2%,v/v)。
           
          由于銅、銀、金、鉑等金屬對(duì)待測(cè)元素的干擾較大,因此,該幾類合金樣品中的砷、硒、碲、汞不宜采用本儀器測(cè)定。
           
          ②有機(jī)或生物固體樣品:樣品經(jīng)硝化處理為溶液并保持適當(dāng)酸度,其介質(zhì)酸度與無機(jī)樣品同。
           
          (3)樣品中待測(cè)元素*
           
          由儀器靈敏度及分析方法決定,樣品含待測(cè)元素上下限為0.05μg/g-500μg/g,不在此含量范圍內(nèi)的樣品使用本儀器檢測(cè)將無法保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。
           
          (4)樣品份量
           
          每檢測(cè)1個(gè)元素,要求固體樣品量不少于2g,液體樣品量不少于20mL,水樣不少于100mL 。
           
          (5)其它
           
          送樣前請(qǐng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料,盡量提供相關(guān)信息。
           
          13.差示掃描量熱儀
           
          固體樣品,在所檢測(cè)的溫度范圍內(nèi)不會(huì)分解或升華,也無揮發(fā)物產(chǎn)生。
          樣品量:?jiǎn)未螜z測(cè)無機(jī)或有機(jī)材料不少于20mg,藥物不少于5mg。送樣時(shí)請(qǐng)注明檢測(cè)條件(包括:檢測(cè)溫度范圍,升、降溫速率,恒溫時(shí)間等)。
           
          14.熱重分析儀
           
          樣品量:不少于30mg。送樣時(shí)請(qǐng)注明檢測(cè)溫度范圍,實(shí)驗(yàn)氣氛(空氣、N2或Ar),升溫速率,氣體流量(如有特殊要求)。
           
          15.X-射線粉末衍射儀
           
          送檢樣品可為粉末狀、塊狀、薄膜及其它形狀。粉末樣品需要量約為0.2g(視其密度和衍射能力而定);塊狀樣品要求具有一個(gè)面積小于45px x 45px的近似平面;薄膜樣品要求有一定的厚度,面積小于45px x 45px;其它樣品可咨詢實(shí)驗(yàn)室。
           
          16.X-射單晶末衍射儀
           
          送檢樣品必須為單晶。選擇晶體時(shí)要注意所選晶體表面光潔、顏色和透明度一致。不附著小晶體,沒有缺損重疊、解理破壞、裂縫等缺陷。晶體長(zhǎng)、寬、高的尺寸均為0.1 -0.4mm,即晶體對(duì)角線長(zhǎng)度不超過0.5mm(大晶體可用切割方法取樣,小晶體則要考慮其衍射能力)。
           
          17.透射電子顯微鏡
           
          由于受電鏡高壓限制,透射電子束一般只能穿透厚度為幾十納米以下的薄層樣品。除微細(xì)粒狀樣品可以通過介質(zhì)分散法并直接滴樣外,其它樣品的制備方法主要有物理減薄(離子和雙噴減薄等)和超薄切片法。
           
          一般情況下,需要采用物理減薄法的樣品制備過程,須由用戶自己完成(不具備此制樣條件的院系,可租用本室的相關(guān)設(shè)備)。超薄切片樣品的制備,需經(jīng)樣品前處理、包埋、切片等復(fù)雜工序,周期較長(zhǎng)(約一周左右)。
           
          由于該儀器是高分辨型電鏡,為確保儀器性能和發(fā)揮其高分辨象觀察特點(diǎn),目前主要接受材料領(lǐng)域的樣品。
           
          18.場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡
           
          送檢樣品必須為干燥固體、塊狀、片狀、纖維狀及粉末狀均可。應(yīng)有一定的化學(xué)、物理穩(wěn)定性,在真空中及電子束轟擊下不會(huì)揮發(fā)或變形;無磁性、放射性和腐蝕性。含水分較多的生物軟組織的樣品制備,要求用戶自己進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥之前的固定、清洗、脫水及用醋酸(異)戊酯置換等處理,最后由本室進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥處理。
           
          觀察圖像樣品應(yīng)預(yù)先噴金膜。一般情況下,樣品盡量小塊些 (≤10x10x5mm 較方便)。粉末樣品每個(gè)需1克左右。納米樣品一般需超聲波分散,并噴涂超細(xì)微金膜。
           
          19.掃描電子顯微鏡-X射線能譜儀
           
          送檢樣品必須為干燥固體,塊狀、片狀、纖維狀、顆粒或粉末狀均可。應(yīng)有一定的化學(xué)、物理穩(wěn)定性,在真空中及電子束轟擊下不會(huì)揮發(fā)或變形;無磁性、放射性和腐蝕性。
           
          對(duì)含水份較多的生物軟組織樣品,要求用戶預(yù)先進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥前的固定、清洗、脫水及用醋酸(異)戊酯置換等處理。最后再由本室進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥處理。圖像觀察樣品應(yīng)預(yù)先鍍金膜,成份分析樣品必需鍍碳膜。一般情況下,樣品體積不宜太大(≤5x5x2mm較適合)。
           
          20.電子探針
           
          定量分析的樣品必須磨平拋光、清洗干凈。若樣品不能進(jìn)行表面磨平拋光(將影響分析精度)處理應(yīng)事先說明。
           
          為測(cè)試方便和節(jié)約機(jī)時(shí),樣品應(yīng)先切成小薄片,不能切割制樣,必須先與測(cè)試人員商量。應(yīng)先標(biāo)記好分析面上的測(cè)試點(diǎn),無標(biāo)記測(cè)試位置時(shí),測(cè)試時(shí)只選有代表性、較平整位置測(cè)試。
           
          液體樣必須先濃縮干燥。分析的樣品必須是在高能電子轟擊下物理和化學(xué)性能穩(wěn)定的固體、不分解、不爆炸、不揮發(fā)、無放射性、無磁性。送樣注明樣品可能包含什么元素。樣品必須噴涂一層碳膜。

           

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