α-淀粉酶活性檢測(cè)試劑盒（微量法）

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1012

產(chǎn)品規(guī)格：100管/48樣

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

淀粉水解酶，包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-AL (EC 3.2.1.1)隨機(jī)催化淀粉中α-1,4-糖苷鍵水解，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時(shí)使淀粉的粘度降低，因此又稱(chēng)為液化酶。淀粉水解酶催化淀粉水解生成還原糖，還原糖還原3,5-二硝基水楊酸生成棕紅色物質(zhì)，在540nm有吸收峰；通過(guò)測(cè)定540nm吸光度增加速率，計(jì)算淀粉酶活性。α-AL耐熱，但是β-淀粉酶可在70℃鈍化15min。因此粗酶液經(jīng)過(guò)70℃鈍化15min，就只有α-AL能夠催化淀粉水解。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者 增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。  

產(chǎn)品內(nèi)容：

溶液的配制：

1. 試劑一：若有黃色晶體析出，需加熱溶解后再用；

2. 試劑二：臨用前加入10mL蒸餾水，置于常溫水中并加熱至煮沸，期間不斷攪拌粉劑至溶解；

3. 標(biāo)準(zhǔn)品：10mg無(wú)水葡萄糖。臨用前加1mL蒸餾水，配成10mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

需自備的儀器和用品：

酶標(biāo)儀或可見(jiàn)分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板/微量玻璃比色皿、研缽/勻漿器和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)） 

稱(chēng)取約0.1g樣本，加0.8mL蒸餾水勻漿；勻漿后在室溫下放置提取15min，每隔5min振蕩1次，使其充分提??；6000g，室溫離心10min，吸取上清液并且加蒸餾水定容至10mL，搖勻，即為淀粉酶原液。

二、測(cè)定步驟

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到540nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為0.5、0.4、0.3、0.2、0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3. 取250μL樣本沸水浴5min作為對(duì)照管使用。

4. 按照操作表依次加入各個(gè)試劑：

混勻，沸水浴10min，取200μL至96孔板或微量比色皿中，540nm處讀取對(duì)照管、測(cè)定管、標(biāo)準(zhǔn)管、空白管的吸光度，分別記為A對(duì)照、A測(cè)定、A標(biāo)準(zhǔn)和A空白，計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。

三、α-淀粉酶活性計(jì)算 

1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：  

以ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為x軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到方程y=kx+b。將ΔA測(cè)定帶入方程得到x （mg/mL）。

2、 α-淀粉酶活性的計(jì)算：

（1）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活力單位。

α-淀粉酶活性(U/g質(zhì)量)=x×V樣÷(W×V樣÷V樣總)÷T=2×x÷W

（2）按照蛋白質(zhì)濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1m 還原糖定義為1個(gè)酶活性單位。

α-淀粉酶活性(U/mg prot)= x×V樣÷（V樣×Cpr）÷T=0.2×x÷Cpr

V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.075mL；V樣總：提取液總體積，10mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，5min。

注意事項(xiàng)：

測(cè)定的吸光值大于1.5時(shí)，可以對(duì)樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后測(cè)定。若吸光值過(guò)小，可以濃縮淀粉酶稀釋液或者淀粉酶原液。