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SKoV-3細(xì)胞培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞

SKoV-3細(xì)胞培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞

-----尚恩生物 186278592O3-----

培養(yǎng)環(huán)境：air, 95%; carbon dioxide (CO2), 5%

細(xì)胞培養(yǎng)操作

換液周期：2-3天

培養(yǎng)基體積：T25瓶10-12ml；10cm皿12-15ml

傳代比例：1:2-1:4（具體情況視細(xì)胞生長(zhǎng)速度及密度決定）

傳代方法：

1.盡量吸干凈T25瓶原培養(yǎng)基；

2.加3-4ml 常溫PBS輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞10-20s，吸走潤(rùn)洗的PBS；

3.T25瓶加1ml左右胰M，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶以使胰M鋪勻瓶底細(xì)胞層；

4.將培養(yǎng)瓶放入37度培養(yǎng)箱消化；

5.消化到細(xì)胞間隙變大，但未*脫落時(shí)加2-3ml*培養(yǎng)基終止胰M消化；

6.混勻細(xì)胞，900rpm離心3-5min，棄上清；

7.加新的*培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞，均勻分到新的培養(yǎng)瓶里；

8.補(bǔ)足*培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；

注意事項(xiàng) 不同品牌胰M消化時(shí)間差別較大，注意嚴(yán)格控制消化時(shí)間

消化傳代細(xì)胞時(shí)吹打細(xì)胞注意盡量輕柔，不要產(chǎn)生過(guò)多氣泡以免影響細(xì)胞狀態(tài)。

三、細(xì)胞凍存操作

凍存液配方：92%FBS+8%DMSO(新手建議)或92%*培養(yǎng)基+8%DMSO(高手建議);

凍存規(guī)格：200-300萬(wàn)/ml，1ml每管

凍存方法：

1.消化并離心獲得細(xì)胞沉淀后，加配置好的凍存液輕輕重懸細(xì)胞；

2.將細(xì)胞懸液盡快移入已經(jīng)做好標(biāo)記的凍存管；

3.將凍存管轉(zhuǎn)入程序凍存盒，放入-80度冰箱過(guò)夜，第二天轉(zhuǎn)入液氮保存；沒(méi)有程序凍存盒的實(shí)驗(yàn)室，加入細(xì)胞后可以將凍存管放在泡沫盒中4度靜置5-10min，再-20度靜置2h后轉(zhuǎn)入-80度過(guò)夜，第二天轉(zhuǎn)入液氮保存

注意事項(xiàng) 凍存細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮后及時(shí)復(fù)蘇一管檢查細(xì)胞凍存活性，若有異常，及時(shí)調(diào)整實(shí)驗(yàn)方案

細(xì)胞培養(yǎng)說(shuō)明

1. 細(xì)胞培養(yǎng)需要充足經(jīng)驗(yàn)，新手或者沒(méi)有類似細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)的人建議在專業(yè)人士指導(dǎo)下進(jìn)行操作，尤其注意無(wú)菌操作、貼壁細(xì)胞消化時(shí)間及細(xì)胞培養(yǎng)密度。

2. 部分細(xì)胞在傳代后時(shí)，會(huì)有以下現(xiàn)象：細(xì)胞內(nèi)會(huì)有黑色小點(diǎn)、細(xì)胞間隙有些顆粒物、培養(yǎng)基漂浮一些死細(xì)胞。以上都是細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)現(xiàn)象，不影響細(xì)胞增殖和實(shí)驗(yàn)。

3. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡、細(xì)胞器折光或者細(xì)胞膜表面物質(zhì)，這個(gè)屬于細(xì)胞自身特性，無(wú)法清除也無(wú)法改變，具體情況可以參考ATCC、DSMZ等大型細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞照片。細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片，可以吸走培養(yǎng)基后用PBS潤(rùn)洗；潤(rùn)洗不能清除的可以消化細(xì)胞重新接種，消化完成后加*培養(yǎng)基終止消化，混勻細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5ml PBS重懸細(xì)胞，再離心后，用*培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時(shí)碎片比較少，傳代時(shí)可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。

4. 不同品牌胰M溶液成分不一樣，消化活性差別比較大，更換胰M品牌時(shí)需重新摸索消化時(shí)間，以消化到細(xì)胞間隙變大但未漂浮為準(zhǔn)，此時(shí)結(jié)束消化最佳，避免消化過(guò)度導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞消化后比較脆弱，吹打力度不要過(guò)大，不要產(chǎn)生過(guò)多氣泡，否則會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞狀態(tài)。

5. 不同細(xì)胞生長(zhǎng)速度差異較大，所有細(xì)胞收貨后第①次傳代建議按1:2傳代。正常培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)較慢、密度較低的細(xì)胞需要傳代時(shí)按1:2傳代，生長(zhǎng)較快、密度較高的細(xì)胞可以按1:4傳代。

6. 細(xì)胞生長(zhǎng)偏慢時(shí)，可以將血清濃度增加到15-20%培養(yǎng)一段時(shí)間，待細(xì)胞狀態(tài)和生長(zhǎng)速度恢復(fù)正常后換回10%血清

相關(guān)培養(yǎng)基均有售：

DMEM高糖

DMEM低糖

1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基

1640*培養(yǎng)基

FK12

IMEM

L15

McCoy's 5A

優(yōu)級(jí)胎牛血清

特級(jí)胎牛血清

新生牛血清

等...