一、顆粒表征
在1981年掃描隧道顯微鏡發(fā)明之前，人們只能進(jìn)行微米量級以上的光學(xué)顯微表征分析。但是大量的科學(xué)研究往往需要表征粒子在納米層面的數(shù)據(jù)，研究者們也已經(jīng)認(rèn)識到納米量級顆粒檢測的重要性。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域如病毒、脂質(zhì)體、外泌體等，無機材料領(lǐng)域如石墨烯、納米硅、納米碳酸鈣、納米金屬粒子等，大量在納米量級的粒子都需要準(zhǔn)確的粒度表征檢測。納米顆粒檢測技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展應(yīng)用對生物醫(yī)學(xué)、材料生產(chǎn)等領(lǐng)域的進(jìn)一步研究有著十分積極的的作用。
目前市場上主要有有兩種原理類型的納米顆粒檢測設(shè)備，一種為基于光學(xué)原理，一種基于為電學(xué)原理。今天我們主要介紹光學(xué)原理制成的DLS（動態(tài)光散射）、NTA（納米顆粒跟蹤分析）等光學(xué)原理的顆粒粒度儀和基于RPS電學(xué)原理智造的Nanocoulter （電阻脈沖傳感電感應(yīng)區(qū)脈沖法）的電學(xué)原理開發(fā)的NanoCoulter（納米庫爾特粒度儀），以及它們之間的性能優(yōu)缺點及數(shù)據(jù)比較。
二、原理介紹
DLS
即動態(tài)光散射法：是指通過測量樣品散射光強度起伏的變化來得出樣品顆粒大小信息的一種技術(shù)。如圖1，之所以稱為“動態(tài)"是因為樣品中的分子不停地做布朗運動，正是這種運動引起散射光的變化。利用散射光隨時間的波動性得到相關(guān)方程，進(jìn)而得到樣品中顆粒的平均運動速率（Dt），并最終得到平均流體力學(xué)直徑。
DLS粒徑檢測具有快速簡單的優(yōu)點，具有一定統(tǒng)計學(xué)意義，但因為散射光強正比于粒徑的6次方（Pscattering∝d6(n2-1)2/λ4 Iincident），所以大顆粒的散射比較強，從而對于寬分布樣品其平均粒徑結(jié)果偏向于大顆粒。因此，DLS適合分布不太寬的單分散體系的粒徑檢測，且動態(tài)光散射實驗易受灰塵或雜質(zhì)影響，故樣品的過濾和離心十分重要。
NTA
即納米粒子跟蹤分析法：NTA的工作原理是通過將一束能量集中的激光穿過玻璃棱鏡對懸浮顆粒的溶液進(jìn)行照射，配以鍍鉻表面的玻璃使背景信號最小化，從而檢測每個顆粒散射光的強度， 觀察納米顆粒在溶液中的布朗運動，并拍攝影像，通過對顆粒的布朗運動進(jìn)行追蹤和分析，根據(jù)Stokes-Einstein方程計算出納米顆粒粒徑，通過顆粒數(shù)量得到濃度。如圖2；
NTA的主要優(yōu)勢是相對于DLS精度更高，有更好的統(tǒng)計學(xué)意義，但跟DLS一樣，由于顆粒都會發(fā)生光散射，顆粒間的信號會有互相遮擋的情況，粒徑仍然會偏向于大顆粒，加上由于有限的拍攝焦平面的限制顆粒三維空間的運動最終在儀器上呈現(xiàn)的其實是二維運動軌跡，所以最終結(jié)果還是會存在一定的偏差。
RPS
即電阻脈沖傳感電阻法原理，也叫：即庫爾特原理，如圖3，是一種單顆粒檢測技術(shù)，電解液中的顆粒通過納米小孔時，在恒電流設(shè)計的電路中，導(dǎo)致電極間電阻發(fā)生瞬時變化，從而產(chǎn)生帶來電流的瞬時變化，所產(chǎn)生的電脈沖幅度和粒徑成正比，脈沖的數(shù)量與顆粒的數(shù)目成正比。
大部分傳統(tǒng)的貝克曼庫爾特粒度儀只能做到微米以上的粒度檢測。，而隨著科技的發(fā)展，芯片生產(chǎn)工藝的極大的提高，納米庫爾特應(yīng)運而生，采用光刻硅基芯片的加工方式進(jìn)行芯片制造，從而開發(fā)出成為新一代納米尺度的顆粒檢測方法。
納米庫爾特電阻法是根據(jù)單個顆粒的真實體積直接測量粒徑，精度非常高，而且對樣本濃度的要求比較低，可以測量其它檢測技術(shù)無法檢測的低濃度樣品。為實現(xiàn)動態(tài)的粒徑測量，電阻脈沖處理器具備時間標(biāo)記功能，可以對每個顆粒過孔的時間點進(jìn)行精準(zhǔn)的記錄，并且可以依據(jù)脈沖分析樣品狀態(tài)的變化，如絮凝、凝聚、沉降、溶解等。
該方法可以一次性檢出顆粒的粒徑、濃度、Zeta電位、形狀多個信息，實現(xiàn)多維度、全方面的檢測。
三、數(shù)據(jù)對比
1、 多分散標(biāo)準(zhǔn)混合樣本
以80nm、120nm、160nm和200nm四種標(biāo)準(zhǔn)聚苯乙烯微球進(jìn)行等比例等濃度混合，模擬多分散樣本的狀態(tài)，用四種方法進(jìn)行測試，結(jié)果如下；
圖4 四種不同的檢測方法測試混合標(biāo)準(zhǔn)PS微球
對于混合樣本的測試，只有RPS還原出了樣本真實的分布情況，顯示出有四個不同粒徑的分布峰顯示樣本的狀態(tài)，因為是等濃度等體積混合，所以RPS是符合樣本實際分布的，而DLS和NTSA都只有一個分布峰，且DLS還缺失了80nm粒徑的顆粒數(shù)據(jù)，相對來說偏差最大，由此可見，RPS的測試精度要遠(yuǎn)高于另外兩種。
2、 實際樣本測試對比
（1）將兩種不同粒徑分布的脂質(zhì)體樣本分別用DLS和NTA進(jìn)行測試，可以明顯看到兩種方法對單分散和多分散樣本的測試差異。
圖5 DLS與RPS測試脂質(zhì)體樣本
對于多分散樣本，兩種方法的檢測結(jié)果都較為準(zhǔn)確和接近，但DLS測試多分散樣本時會明顯偏向大顆粒，導(dǎo)致其粒徑檢測值偏大。
（2）下圖為一個分布較寬的外泌體樣本，用兩款不同型號的NTA設(shè)備同時和RPSRPS法分別進(jìn)行測試，結(jié)果如下；
圖6 DLS與NTA測試外泌體樣本
從拍攝的冷凍電鏡圖可以看到，該外泌體粒徑分布較廣，不過大部分顆粒還是集中分布在60-90納米nm，RPS的測試結(jié)果與該結(jié)論吻合。NTA的粒徑相對偏大很多，對光學(xué)儀器來說，大顆粒間的遮擋還是會對最終的數(shù)據(jù)造成較大的影響，電學(xué)原理則沒有這方面的顧慮。
3、性能對比
表1三種檢測方法對比
4、總結(jié)
電阻法（RPS）在顆粒粒徑表征檢測方面有著單顆粒檢測、精確度高、分辨率高等許多的優(yōu)良特性突破性優(yōu)勢，并且還將隨著相應(yīng)科技的不斷發(fā)展，進(jìn)行迭代升級以適應(yīng)更多的應(yīng)用領(lǐng)域和樣本類型，努力為納米顆粒的科學(xué)研究和生產(chǎn)應(yīng)用提供更多更全面的幫助。
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