二、線性化載體

三、純化PCR、酶切產(chǎn)物并連接

將反應(yīng)結(jié)束的產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化所選用的方法對污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好，目前有多種試劑盒可供選擇；

連接線性化載體和PCR產(chǎn)物，可根據(jù)DNA連接酶試劑盒說明書設(shè)置，對于較大的片段可以選擇4℃連接過夜。

四、細(xì)菌轉(zhuǎn)化

冰上解凍克隆感受態(tài)細(xì)胞（DH5α）；取重組產(chǎn)物，加至感受態(tài)細(xì)胞中，冰上靜置30min，42℃水浴熱激45s，迅速置于冰上2-3min；加入600μL LB液體培養(yǎng)基,37℃搖菌1h。

PCR正常反應(yīng)結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，選擇正確條帶的菌液加入對應(yīng)的培養(yǎng)基，37℃搖起來。

注意事項(xiàng)：

②菌落PCR反應(yīng)程序變性94℃4-5min即可保證外源DNA釋放出來。

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