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應用文集｜肽譜分析“柱”力提高生物制藥關(guān)鍵質(zhì)量屬性
肽譜分析是一種強大的技術(shù)，可用于全面鑒定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，還能夠區(qū)分蛋白質(zhì)內(nèi)異構(gòu)基團的準確位置。由于重組蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)或氨基酸序列是已知的，因此能夠預測在使用酶（例如胰蛋白酶）酶解蛋白質(zhì)時將生成的片段。胰蛋白酶通過水解賴氨酸或精氨酸，以及除脯氨酸以外的任何其他氨基酸之間的鍵將蛋白質(zhì)分解成片段。使用這種方法，曲妥珠單抗將被分解成 62 種單獨的片段，并且高分離度反相分離能夠?qū)⑦@些物質(zhì)分離成經(jīng)典的“指紋"色譜圖。將分離與質(zhì)譜檢測相結(jié)合，能夠?qū)㈦淖V分析色譜圖中觀察到的實際峰值與分析軟件預測的預期片段相關(guān)聯(lián)。
不同蛋白質(zhì)將產(chǎn)生不同的肽“指紋"，這些肽段具有不同的大小（從單個氨基酸和二肽到更大的多肽）并具有不同程度的疏水性。因此，推薦用于此類分離的色譜柱是表面多孔或全多孔顆粒填料的 C18 反相色譜柱。
今天，安捷倫將與你同行一起研究如何多方式高效率地進行肽譜分析。我們將分別從蛋白質(zhì)解酶五部曲、反向色譜法、分離*條件等部分為大家分類介紹如何從肽譜分析的不同樣品制備方法出發(fā)，結(jié)合色譜柱的選擇以及色譜條件，探索對于肽譜分析的影響。精準定量全面鑒定蛋白質(zhì)肽譜分析研究的完整工作流程及應用案例，進而“柱"力提高生物藥行業(yè)關(guān)鍵質(zhì)量屬性。
入門指南篇
樣品前處理對于成功的肽譜分析至關(guān)重要。這可能是一個耗時的過程，其中可能需要針對酶解的各種蛋白質(zhì)優(yōu)化多個步驟。對于肽譜分析樣品體積較大的用戶可能想要通過自動化提高速度并改善重現(xiàn)性。
使用三氟乙酸作為離子對試劑可獲得更出色的峰形，并且 AdvanceBio 肽譜分析色譜柱是該分離的理想選擇。該色譜柱含有 120 ? 孔徑的 Poroshell 顆粒，并提供優(yōu)異的分離度和峰容量，且無需采用 UHPLC 儀器。對于使用質(zhì)譜檢測的應用，通常優(yōu)先選擇甲酸作為離子對試劑。在此類情況下，AdvanceBio Peptide Plus 色譜柱將提供更出色的分離譜圖。AdvanceBio Peptide Plus 也推薦用于需要采用較大的樣品載樣量以檢測微量雜質(zhì)的情況。對于親水性極強的小分子肽，推薦使用 AdvanceBio 肽譜分析以實現(xiàn)更好的保留。
蛋白質(zhì)解酶五部曲
處理蛋白質(zhì)以增強肽譜分離在分析前，需要很好地了解蛋白質(zhì)酶解的步驟，這有助于確保酶解過程完整、成功地進行，以及幫助您更自信地選擇策略。通常情況下，酶解方法需要一套獨立的開發(fā)方案，以提供充足穩(wěn)定的樣品進行 LC 進樣。雖然酶解過程的優(yōu)化有許多選擇可以考慮，但還是需要遵循一些常用方法。蛋白質(zhì)酶解可分為五個步驟，如表 1 中總結(jié)：(1) 樣品前處理，(2) 選擇裂解試劑，(3) 還原/烷基化，(4) 酶解過程，(5) 富集/純化。
表 1. 蛋白質(zhì)酶解的五個步驟
*更多詳情請參考文末“碼"上下載——肽譜分析應用文集5994-0037ZHCN
反相色譜法
在選擇肽譜分析色譜柱和方法時，終往往是依據(jù)所分析的蛋白質(zhì)和工作流程的目的而決定常用的肽譜分析色譜柱方法（特別是在生物制藥領域）是反相色譜法 (RPC)。出色的分離能力及揮發(fā)性流動相（與質(zhì)譜儀兼容）的使用，使得這種技術(shù)成為大多數(shù)多肽分離中的主要 HPLC 方法。其分離速度和效率均優(yōu)于其他的 HPLC 分離模式，可謂是肽譜分析的“理想之選"圖 1 顯示了使用方法 A 和 B，通過 Agilent 1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)分離 NISTmAb 胰蛋白酶酶解產(chǎn)物得到的色譜圖。選取 8 個峰用于后續(xù)的保留時間精度和峰容量計算。
圖 1. 使用方法 A 和 B，通過 Agilent 1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)分離 NISTmAb 胰蛋白酶酶解產(chǎn)物得到的色譜圖。選取 8 個峰用于后續(xù)的保留時間精度和峰容量計算
成功進行肽譜分離的必備條件
一般情況，需要很好地了解多肽特定的色譜柱要求，以及色譜方法開發(fā)過程來開發(fā)實用性 RPC 肽譜分析方法。雖然很多相同的色譜原則同時適用于多肽和小分子分離，但在優(yōu)化多肽方法、獲取可重現(xiàn)的穩(wěn)定分離中，還是有許多條件特異性變量。色譜柱選擇、色譜柱質(zhì)量、流動相選擇及檢測要求均是肽譜分離的重要因素，可大大改善肽譜的質(zhì)量。
圖 2. AdvanceBio SEC 色譜柱
色譜柱選擇
為獲取可靠、分離度良好的肽譜分離，其中重要的因素是選擇合適的色譜柱。色譜柱孔徑、填料類型和粒徑、鍵合相化學性質(zhì)和穩(wěn)定性（化學床和填充床）在改善肽譜分離、優(yōu)化策略和光譜分析中有著重要作用。對于多肽分離，首選的色譜柱孔徑范圍為 100 ?–120 ?，而優(yōu)化的固定相選擇通常為 C18。雖然一些商業(yè)化色譜柱可針對多肽分離提供低至 60 ? 的孔徑，但是這些色譜柱常用于較小肽段碎片或標準品的分析。同樣地，一些較小的鍵合相碳鏈長度也在使用中，但這與特定的方法相關(guān)，在獲取寬范圍 的疏水性多肽保留時，實用性較為有限。
由于多肽的擴散系數(shù)較高，因此其分離的塔板數(shù)較小，適合于在較低流速下，使用更小直徑的全多孔色譜柱材料。由此衍生出亞 2 µm 的填料，用以更高效的肽譜分析。但是目前，表面多孔色譜柱越來越多的使用于生物分離（尤其是在生物制藥行業(yè)），因為這種材料解決了蛋白質(zhì)和多肽的質(zhì)量擴散問題。這些色譜柱的擴散路徑更短，可在較高的線性速度下分離較大的分子，不會由于粒徑的減少而出現(xiàn)系統(tǒng)反壓增加的問題。圖 3 所示為使用表面多孔色柱所得的快速高分離度肽譜示例。
圖 3. BSA 的反相分離圖，采用 Agilent AdvanceBio 肽譜分析 2.1 × 150 mm 色譜柱（安捷倫部件號 653750-902）。肽譜分析條件為 0.3 mL/min，40 °C，流動相為水（含 0.1% TFA）/乙腈 (0.08%)，線性梯度
色譜柱質(zhì)量（多次運行間的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性）是維持肽譜分離重現(xiàn)性和穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，有時會被忽略。反相多肽分離常在低 pH(pH < 3)、高溫下(> 40 °C)進行。
肽譜分析依賴于色譜柱的可重現(xiàn)操作，以獲取準確的指紋圖譜和重復驗證的方案。在為肽譜分析選擇一種色譜柱時，整個決策流程中應優(yōu)先考慮色譜柱質(zhì)量。圖 4 所示為具有優(yōu)異可重現(xiàn)性的單克隆抗體胰蛋白酶水解物肽譜，在低 pH 和高溫條件下分離，并進行了 LC/MS 分析。
圖 4. 一種單克隆抗體胰蛋白酶水解物的五次重復進樣，在 Agilent 1200 液相色譜系統(tǒng)與 6520 Q-TOF 的聯(lián)用系統(tǒng)上使用 3.0 × 150 mm 的 Agilent AdvanceBio 肽譜分析色譜柱（安捷倫部件號 653950-302）。分離條件為 0.3 mL/min，40 °C，流動相為水（含 0.1% FA）/乙腈（含 0.1% FA），梯度洗脫
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此外，本篇應用文集中還包含合成肽及其雜質(zhì)的分析、對于用于肽譜分析的高通量蛋白質(zhì)酶解，AssayMAP Bravo 平臺支持自動化樣品前處理。更多信息可供查閱。
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