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合成生物學(xué)前沿 | 堿基編輯“傳感器”文庫將單堿基突變置于聚光燈下
合成生物學(xué)是生物學(xué)工程化高度交叉的前沿學(xué)科研究領(lǐng)域，包含幾個不同的研究層次：認(rèn)識生命、改造生命和創(chuàng)造生命；要想實現(xiàn)其終極目標(biāo)，還需要在生命本質(zhì)探索及相關(guān)技術(shù)的不斷創(chuàng)新與應(yīng)用上持續(xù)深入?；蚓庉嫾夹g(shù)是合成生物學(xué)領(lǐng)域的一類重要工具，能夠?qū)崿F(xiàn)基因組的定向修改，如插入、刪除、修改、替換。
本期內(nèi)容聚焦一項發(fā)表在 Nature Biotechnology 上的基因編輯創(chuàng)新研究，來自于美國麻省理工科赫綜合癌癥研究所的腫瘤生物學(xué)家 Francisco J. Sánchez-Rivera，題目為“Base editing sensor libraries for high-throughput engineering and functional analysis of cancer-associated single nucleotide variants”[1]。該研究通過構(gòu)建一個可以測量堿基編輯器工作效率及精度的“傳感器”文庫工具，并提供相應(yīng)的線上應(yīng)用軟件 BE-SCAN，助力其他研究者更加容易地設(shè)計基于堿基編輯器的分子元件，加速實現(xiàn)研究目的。本文中的“傳感器”文庫是由安捷倫 SurePrint 高保真寡核苷酸文庫合成平臺提供的。
該研究的亮點包括：
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獨(dú)創(chuàng)性設(shè)計了堿基編輯“傳感器”，為單堿基變異的高通量篩選和功能研究提供有力工具；
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通過檢測 20 萬種“堿基編輯器 -sgRNA- 細(xì)胞類型”組合，為“傳感器”工具積累了充分?jǐn)?shù)據(jù)；
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利用體外細(xì)胞和體內(nèi)動物實驗，驗證“傳感器”在構(gòu)建單堿基突變體和高通量功能篩選上的有效性，并且發(fā)現(xiàn)之前未被研究報道過的重要 TP53 突變位點；
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搭建了靈活的生信方法 AMINEsearch 和線上軟件 BE-SCAN，可以幫助更多研究者進(jìn)行單堿基突變研究。
堿基編輯器和
堿基編輯“傳感器“工具
CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的經(jīng)典基因編輯技術(shù)[2]，通過 Cas9 蛋白在 DNA 靶標(biāo)形成雙鏈斷裂（DSB），利用體內(nèi)的修復(fù)機(jī)制，產(chǎn)生定向插入、刪除等隨機(jī)修飾，但很難實現(xiàn)精準(zhǔn)的單堿基替換。然而，單堿基變異可以導(dǎo)致很多已知疾病的發(fā)生，與日俱增的基因組測序研究也在積累大量意義不確定的點突變，因此堿基編輯器（BE）技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生 [3]。與經(jīng)典的 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)相比，BE 技術(shù)主要對Cas9蛋白模塊做了修改，一方面將 Cas9 蛋白切割產(chǎn)生雙鏈斷裂功能失活，另一方面在失活的 Cas 蛋白上融合脫氨酶模塊，從而實現(xiàn)單堿基的替換，如將某位點的 C 轉(zhuǎn)換成 T 的胞嘧啶堿基編輯器（CBE）。
本文就是在 CBE 的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了堿基編輯器“傳感器”工具，用來檢測多種 CBE 系統(tǒng)的編輯效率和精準(zhǔn)度。如圖 1 所示，在慢病毒載體上，將 sgRNA 序列與對應(yīng)的同源目標(biāo)序列順式連接，形成“傳感器”序列。將裝載不同“傳感器”序列的載體轉(zhuǎn)染到可以表達(dá)堿基編輯酶組分的細(xì)胞系后，可以實現(xiàn)高通量堿基編輯。通過進(jìn)一步對“傳感器”編碼區(qū)域進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增和高通量測序，就可以測量每個具體的“編輯器 +sgRNA+ 靶標(biāo)序列”的堿基編輯效率。
圖 1. 堿基編輯“傳感器”示意圖
構(gòu)建基于真實世界臨床腫瘤數(shù)據(jù)的
堿基編輯“傳感器”文庫
如圖 2 所示，為了使堿基編輯“傳感器”的元件設(shè)計更加簡便，作者團(tuán)隊搭建了一款設(shè)計算法 AMINEsearch。接下來，作者從腫瘤大 panel 檢測項目 MSK-IMPACT 的分析數(shù)據(jù)中提取了部分突變數(shù)據(jù)集，通過 AMINEsearch 軟件，設(shè)計出人的腫瘤傳感器文庫（HBES），共包括 5855 個 sgRNAs 序列、靶向 1450 個點突變。通過將 HBES 比對到小鼠的同源序列位點，設(shè)計出針對小鼠的腫瘤傳感器文庫（MBES），共包括 4686 個 sgRNAs 序列、靶向 1177 個點突變。
圖 2. 堿基編輯“傳感器”算法和線上應(yīng)用示意圖
值得一提的是，在初步構(gòu)建兩個文庫時，作者發(fā)現(xiàn)有將近一半的文庫序列發(fā)生了錯誤。在反復(fù)試錯和優(yōu)化后，最終通過與安捷倫合作，使用 SurePrint 高保真 OLS 平臺，才得以合成低錯誤率的“傳感器”序列。如作者所言，“這真的是我們可以合成傳感器結(jié)構(gòu)的唯一方式”。
圖 3. 文章的方法部分，使用安捷倫 SurePrint 高保真寡核苷酸文庫合成平臺構(gòu)建“傳感器”序列
在后續(xù)的文庫篩選中，HBES 和 MBES 被分別轉(zhuǎn)染到可以表達(dá)堿基編輯系統(tǒng)的細(xì)胞系 MDA-MB-231 中，共測試了三種堿基編輯系統(tǒng)。結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，PAM 模式、目標(biāo)胞嘧啶位置和雙核苷酸序列背景對堿基編輯效率有顯著影響。為了進(jìn)一步探索不同細(xì)胞系的表現(xiàn)，作者又納入 4 種額外的細(xì)胞系，并發(fā)現(xiàn)雖然不同細(xì)胞系的編輯效率不一，但在 PAM 偏好性、編輯窗口容許范圍和單一 sgRNA 序列編輯效率上是高度一致的。至此，本研究共檢測 20 萬種“堿基編輯器 -sgRNA- 細(xì)胞類型”的組合，為“傳感器”工具積累了充分?jǐn)?shù)據(jù)。除了關(guān)注目標(biāo)位點 C-T 轉(zhuǎn)化結(jié)果，作者還對非靶標(biāo) C-T 轉(zhuǎn)化和非經(jīng)典的 C-G 顛換進(jìn)行分析，因篇幅限制不再贅述。
驗證三連擊
內(nèi)源目標(biāo)編輯驗證+
小規(guī)模功能驗證+高通量功能挖掘
內(nèi)源目標(biāo)編輯驗證：
在利用“傳感器”工具在細(xì)胞內(nèi)引入堿基編輯時，此效應(yīng)會同時作用在傳感器同源序列和細(xì)胞的內(nèi)源序列。為了檢測兩種效應(yīng)間的一致性，作者進(jìn)行了 13 個 sgRNA 的小規(guī)模測試。結(jié)果表明（圖 4），在 50% 的情況下，內(nèi)源編輯效率與“傳感器”數(shù)據(jù)的差距在 10% 以內(nèi)，顯示了“傳感器”對內(nèi)源目標(biāo)編輯效率預(yù)測的有效性。
圖 4. 內(nèi)源目標(biāo)基因編輯效率驗證（vs“編輯器”預(yù)測數(shù)據(jù)）
小規(guī)模功能驗證：
TP53 是常見的腫瘤抑制基因，在腫瘤組織中發(fā)生突變的頻率高，且有較高的突變異質(zhì)性 [4]，故作為小規(guī)模功能驗證的靶標(biāo)基因。在小鼠文庫（MBES）的候選者中，挑選了 5 條編輯效率較高、不容易引起額外突變的 sgRNA 序列進(jìn)行后續(xù)驗證實驗。在小鼠胰腺癌模型細(xì)胞系生長實驗中，相比于對照細(xì)胞，引入堿基編輯的細(xì)胞系在 Nutlin-3（一種促進(jìn) TP53 抑癌效應(yīng)的物質(zhì)）添加的環(huán)境中生長情況更好，顯示了 TP53 功能在一定程度上得到了抑制。如圖 5，進(jìn)一步在小鼠中的體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，移植了被堿基編輯的細(xì)胞系的小鼠，在 100 天內(nèi)均因胰腺腫瘤死亡。對腫瘤組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)位點發(fā)生了大量的 C-T 突變。
圖 5. 小規(guī)模功能驗證結(jié)果
高通量功能挖掘：
因為“傳感器”工具可以同時編輯傳感器序列和內(nèi)源序列，因此內(nèi)源序列突變導(dǎo)致的細(xì)胞表型變化可以與傳感器序列編輯效率相關(guān)聯(lián)，并且理論上也可以發(fā)掘已經(jīng)發(fā)生單堿基突變但未導(dǎo)致顯著表型效應(yīng)的位點。如圖 6 所示，將小鼠文庫（MBES）進(jìn)行小鼠胰腺癌模型細(xì)胞系轉(zhuǎn)染，通過體外細(xì)胞增殖篩選，發(fā)掘到 150 個對增殖生長有顯著效應(yīng)（促進(jìn)或者抑制）的 sgRNA。其中有促進(jìn)生長作用的 sgRNA 靶向不少與致癌（如 Jak3、Fgfr2）或抑癌（如 Trp53、Apc）有關(guān)的基因。在這些候選 sgRNA 中，進(jìn)一步對靶向 Trp53 位點進(jìn)行功能挖掘，找到一系列在體內(nèi)和/或體外編輯效率較高的位點，其中點突變位點 T211I（小鼠中對應(yīng)位點是 T208I）被認(rèn)定為胰腺癌小鼠模型中的驅(qū)動突變。
圖 6. 高能量功能挖掘流程示意圖
結(jié)語
堿基“傳感器”的線上軟件工具 BE-SCAN 已經(jīng)開發(fā)，網(wǎng)站地址是 https://dowlab.shinyapps.io/BEscan/，可以為其他研究者提供驗證數(shù)據(jù)參考和元件設(shè)計支持。
未來，Sánchez-Rivera 博士團(tuán)隊將把“傳感器”工具拓展到“先導(dǎo)編輯”技術(shù)中，進(jìn)一步擴(kuò)大該工具的基因編輯應(yīng)用范圍。
安捷倫 SurePrint 寡核苷酸合成平臺將繼續(xù)為廣大研究者提供最高質(zhì)量的底層工具，助力科學(xué)創(chuàng)新更進(jìn)一步！
圖 7. SurePrint DNA 寡核苷酸合成技術(shù)示意圖
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參考文獻(xiàn)：
[1] Sánchez-Rivera, F.J., Diaz, B.J., Kastenhuber, E.R. et al. Base editing sensor libraries for high-throughput engineering and functional analysis of cancer-associated single nucleotide variants. Nat Biotechnol 40, 862–873 (2022).
[2] Martin Jinek et al. A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity.Science337,816-821(2012).
[3] Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A. & Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420–424 (2016).
[4] Kastenhuber, E. R. & Lowe, S. W. Putting p53 in context. Cell 170, 1062–1078 (2017).