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前沿 | 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院張金蘭/蔣建東團(tuán)隊(duì)揭示燈盞乙素通過(guò)調(diào)控Pdk-Pdc軸及線粒體有氧糖代謝挽救線粒體損傷
線粒體功能障礙被認(rèn)為是衰老、阿爾茨海默病（AD）和血管性癡呆（VAD）等的共同致病機(jī)制。然而，目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)特定的潛在分子可以通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體代謝和修復(fù)線粒體損傷來(lái)治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
燈盞乙素（SG）是來(lái)源于燈盞細(xì)辛中的一種黃酮類化合物，SG 已被證明具有廣泛的心腦血管及神經(jīng)變性保護(hù)藥理活性。而線粒體是細(xì)胞的能量工廠，線粒體生物能缺陷及其導(dǎo)致的葡萄糖基礎(chǔ)代謝降低是促進(jìn)神經(jīng)退行性病變等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)鍵病理生理調(diào)節(jié)因子之一。神經(jīng)細(xì)胞和腦組織的功能高度依賴線粒體功能，神經(jīng)遞質(zhì)代謝與神經(jīng)細(xì)胞的能量代謝密切相關(guān)，從能量代謝角度研究 SG 對(duì)線粒體及神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用具有重要意義。
近期北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所/醫(yī)藥生物技術(shù)研究所張金蘭教授/蔣建東院士團(tuán)隊(duì)在 Advanced Science（IF=15.1）上發(fā)表了題為“Scutellarin Rescued Mitochondrial Damage through Ameliorating Mitochondrial Glucose Oxidation via the Pdk-Pdc Axis”的研究[1]，該研究首次發(fā)現(xiàn)了燈盞乙素靶向腦組織線粒體丙酮酸脫氫酶激酶-丙酮酸脫氫酶復(fù)合物軸（PDK-PDC）調(diào)控線粒體有氧代謝，能夠挽救受損的線粒體，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)的作用。研究結(jié)果表明，改善線粒體生物能缺陷的活性成分對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療具有重要價(jià)值。
整體研究策略
研究團(tuán)隊(duì)建立了靶向線粒體代謝及功能的活性成分發(fā)現(xiàn)和藥效評(píng)價(jià)方法：
首先基于活細(xì)胞能量代謝分析發(fā)現(xiàn)對(duì)線粒體有氧糖代謝有調(diào)控作用的活性物質(zhì)
同時(shí)開(kāi)展亞細(xì)胞水平線粒體蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)和 13C 同位素標(biāo)記代謝流示蹤研究，明確活性物質(zhì)調(diào)控的代謝物流向和通量，以及調(diào)控的代謝酶
進(jìn)一步基于激酶活性分析、質(zhì)譜分析和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)確證蛋白-活性成分的結(jié)合作用及結(jié)合口袋，最終揭示燈盞乙素靶向腦組織線粒體、調(diào)控線粒體有氧代謝及挽救受損的線粒體，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)的作用機(jī)制
研究結(jié)果
活細(xì)胞能量代謝分析
采用安捷倫 Seahorse XFe96 analyzer 進(jìn)行活細(xì)胞能量代謝分析，活細(xì)胞能量代謝實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，SG 可同時(shí)增強(qiáng)糖酵解和氧化磷酸化（OXPHOS）過(guò)程，來(lái)緩解線粒體損傷導(dǎo)致的葡萄糖代謝低下。
圖 1. NaN3 誘導(dǎo)線粒體 OXPHOS 損傷和 SG 處理后實(shí)時(shí) ECARs 和 OCRs 的評(píng)估。A）糖酵解應(yīng)激試驗(yàn)結(jié)果。B）對(duì)照組、模型組和 SG 治療組糖酵解和糖酵解能力的 ECARs。
蛋白組學(xué)研究
提取大鼠腦組織中的線粒體進(jìn)行非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究，結(jié)果顯示線粒體組間差異蛋白主要與線粒體電子呼吸鏈及其上游糖酵解和 TCA 循環(huán)途徑密切相關(guān)。這表明 SG 可增強(qiáng)線粒體有氧呼吸及其上游途徑，增加氫質(zhì)子和電子供應(yīng)，增強(qiáng) OXPHOS 相關(guān)蛋白功能并最終降低線粒體損傷。
線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)揭示了 SG 對(duì)氧化磷酸化和能量代謝途徑的調(diào)節(jié)作用。
代謝組學(xué)與代謝流研究
基于上述研究結(jié)果，進(jìn)一步采用安捷倫 1290UHPLC/6550Q-TOF 開(kāi)展了代謝組學(xué)和代謝流研究，以驗(yàn)證 SG 對(duì)線粒體損傷期間生物能缺乏的調(diào)節(jié)作用。
代謝組學(xué)分析表明 SG 顯著增加了 TCA 循環(huán)中富馬酸和蘋果酸的豐度，以及連接糖酵解和 TCA 循環(huán)的關(guān)鍵代謝物丙酮酸的豐度。
圖 2. A：主成分分析（PCA）顯示，對(duì)照組、模型組和 SG 組差異顯著；B：27 種代謝物涉及的能量代謝相關(guān)途徑分析
代謝流分析：對(duì) SK-N-SH（人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞）細(xì)胞的糖酵解和三羧酸循環(huán)通路開(kāi)展了 [13C6]-葡萄糖示蹤分析。結(jié)果顯示，SG 作用能顯著逆轉(zhuǎn)線粒體損傷下糖酵解過(guò)程中 [13C6]-葡萄糖-6-磷酸和 [13C3]-丙酮酸的豐度改變，而 [13C3]-乳酸豐度無(wú)顯著差異，表明糖酵解增強(qiáng)并未通過(guò)乳酸代謝途徑增加能量供應(yīng)，而主要流向丙酮酸代謝。尤為重要的是，SG 顯著增強(qiáng)了 [13C3]-丙酮酸到 [13C2]-乙酰輔酶 A 的代謝流量，從而增強(qiáng)了線粒體葡萄糖源的有氧呼吸。在 TCA 循環(huán)中，SG 顯著逆轉(zhuǎn)了 [13C4]-琥珀酸、[13C4]-富馬酸和 [13C4]-蘋果酸代謝流量。總之，作者發(fā)現(xiàn) SG 通過(guò) PDK-PDC 軸調(diào)節(jié) [13C3]-丙酮酸到 [13C2]-乙酰輔酶 A 的流量是 SG 對(duì)抗線粒體 OXPHOS 損傷的關(guān)鍵點(diǎn)。
圖 3. 13C MFA 和 western blotting 結(jié)果顯示 SG 能夠調(diào)節(jié)葡萄糖-丙酮酸 - TCA 循環(huán)過(guò)程相關(guān)的丙酮酸代謝
蛋白-活性成分的結(jié)合作用確證
基于激酶活性評(píng)估結(jié)果，進(jìn)一步結(jié)合分子對(duì)接、免疫共沉淀（co-IP）、限制性蛋白水解-質(zhì)譜（Lip-MS）、藥物親和反應(yīng)的靶點(diǎn)穩(wěn)定性（DARTS）和細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移分析（CETSA）等實(shí)驗(yàn)，作者得出結(jié)論，SG 與 PDK2 蛋白相互作用，并可能通過(guò)與 PDK2 的硫酰胺結(jié)合口袋（lipoamide-binding）結(jié)合來(lái)抑制其活性。
為驗(yàn)證 SG 通過(guò)調(diào)節(jié) PDK-PDC 軸發(fā)揮線粒體保護(hù)和神經(jīng)保護(hù)作用功能，作者構(gòu)建了 shPDK2 SK-N-SH 細(xì)胞系（PDK2 基因敲低的 SK-N-SH 細(xì)胞系），發(fā)現(xiàn) SG 以 PDK2 為靶標(biāo)對(duì)疊氮鈉（NaN3）誘導(dǎo)的線粒體膜電位損傷和線粒體有氧呼吸損傷發(fā)揮保護(hù)作用。此外，作者還通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究了 SG 對(duì)線粒體損傷引起細(xì)胞死亡的影響。差異蛋白在生物學(xué)過(guò)程分析中與多種凋亡過(guò)程有關(guān)。B 細(xì)胞淋巴瘤（Bcl-2）家族的一組蛋白質(zhì)與腦缺血中神經(jīng)元死亡的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。Bcl-2 蛋白家族是線粒體外膜通透性的主要調(diào)節(jié)因子，在內(nèi)在凋亡途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用。細(xì)胞色素 c 被釋放到胞質(zhì)溶膠中，并通過(guò)細(xì)胞凋亡觸發(fā)程序性細(xì)胞死亡。細(xì)胞色素 c 的釋放及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡由 Bcl-2 家族控制。
在本研究中，作者發(fā)現(xiàn) SG 在不同濃度下顯著降低了由線粒體損傷引起的對(duì)照組 SK-N-SH 細(xì)胞凋亡，但在 shPDK2 SK-N-SH 細(xì)胞中沒(méi)有觀察到這種現(xiàn)象。同時(shí)，蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)了線粒體損傷和 SG 給藥對(duì) Bcl-2 蛋白、細(xì)胞色素 c 和其他凋亡相關(guān)蛋白的影響，表明 SG 通過(guò)靶向 PDK2 調(diào)節(jié)線粒體依賴性細(xì)胞凋亡。
綜上，該研究探索了新的潛在治療方法：基于 PDK-PDC 軸治療大腦低灌注引起的神經(jīng)損傷和認(rèn)知障礙，并發(fā)現(xiàn) SG 通過(guò)特異性靶向 PDK2 發(fā)揮線粒體保護(hù)和抗凋亡活性。
圖 4. SG 調(diào)節(jié) PDK-PDC 軸和線粒體葡萄糖氧化發(fā)揮線粒體保護(hù)和抗凋亡活性
結(jié)論與展望
本研究開(kāi)展了靶向 PDK-PDC 軸調(diào)控線粒體能量代謝的活性成分發(fā)現(xiàn)和機(jī)制研究工作：
基于組織病理、線粒體形態(tài)、線粒體關(guān)鍵參數(shù)、活細(xì)胞能量代謝分析等發(fā)現(xiàn)對(duì)線粒體有氧糖代謝調(diào)控作用的活性物質(zhì)燈盞乙素
同時(shí)開(kāi)展線粒體蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)和 13C 同位素標(biāo)記代謝流研究，發(fā)現(xiàn) SG 調(diào)控的代謝物通路和關(guān)鍵代謝物流量及其調(diào)控的代謝酶
然后基于激酶活性分析、質(zhì)譜分析和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)確證蛋白-小分子結(jié)合作用。通過(guò)以上研究發(fā)現(xiàn)了 SG 發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制及靶點(diǎn)，即 SG 通過(guò)抑制 PDK2 增強(qiáng) PDK-PDC 軸功能，促進(jìn)了線粒體有氧糖代謝和線粒體膜電位，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)線粒體依賴性細(xì)胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用
本研究采用多組學(xué)、代謝流結(jié)合細(xì)胞能量代謝分析，同時(shí)與多種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)交叉驗(yàn)證揭示了燈盞乙素通過(guò)調(diào)控 Pdk-Pdc 軸及線粒體有氧糖代謝挽救線粒體損傷的機(jī)制，為基于線粒體 PDK2 靶標(biāo)的神經(jīng)保護(hù)作用藥物開(kāi)發(fā)提供了新策略。
* 張金蘭研究員和蔣建東院士為該論文的共同通訊作者；生寧副研究員、博士研究生張智慧與鄭浩是該論文的共同第一作者。
參考文獻(xiàn)：
[1] Sheng N, Zhang Z, Zheng H, Ma C, Li M, Wang Z, Wang L, Jiang J, Zhang J. Scutellarin Rescued Mitochondrial Damage through Ameliorating Mitochondrial Glucose Oxidation via the Pdk-Pdc Axis. Adv Sci. 2023 Sep 26:e2303584.