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酶標(biāo)儀高端玩家指南：搭載合成生物學(xué)傳感器的可穿戴設(shè)備研發(fā)
每當(dāng)凜冬來臨，各種病毒病原體愈發(fā)蠢蠢欲動(dòng)，走了新冠病毒來了支原體，時(shí)不時(shí)甲流乙流也來發(fā)動(dòng)助攻。當(dāng)下使用智能手表檢測心率、血氧飽和度等已經(jīng)非常普及，那么有沒有更好的方式能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)來襲的各種討厭的病毒呢？放心，來自全球各地的科學(xué)家正在火熱的研究各種新鮮好玩的可穿戴傳感器。
大家可能想不到，在這樣一個(gè)揉合了多學(xué)科的好玩前沿領(lǐng)域中，名不見經(jīng)傳的多功能酶標(biāo)儀（學(xué)名多功能微孔板檢測儀），究竟能發(fā)揮什么樣的作用呢？接下來，就讓我們圍觀一下來自全球高端玩家的玩機(jī)指南吧！
無細(xì)胞冷凍干燥可穿戴技術(shù)（wFDCF）
來自哈佛大學(xué)Wyss生物啟發(fā)工程研究所和麻省理工學(xué)院的研究人員開發(fā)了一種基于 CRISPR 技術(shù)的可穿戴的合成生物學(xué)傳生物感器，在無需引入活工程細(xì)菌的情況下，只需簡單的水溶液暴露，即可激活該生物傳感器（wearable freeze-dried, cell-free, wFDCF），從而用以檢測環(huán)境中的病原體和毒素，并發(fā)出熒光信號(hào)報(bào)告。更棒的是，研究團(tuán)隊(duì)還將這一技術(shù)集成到了標(biāo)準(zhǔn)口罩中，以檢測患者呼吸中，以及空氣中是否存在 SARS-CoV-2 病毒，該技術(shù)的檢測限可以與目前的實(shí)驗(yàn)室方法（例如 qPCR）相媲美。
在這項(xiàng)研究種，Agilent BioTek 的 SynergyNEO HTS 多功能酶標(biāo)儀主要用于適配 wFDCF 傳感器的紡織物材料的高通量篩選，以及驗(yàn)證基于 CRISPR 的 wFDCF 傳感器用于 RNA 直接檢測的有效性這兩方面。
SnynergyNEO 開展紡織品中 FDCF 合成生物學(xué)反應(yīng)的高通量篩選
研究團(tuán)隊(duì)最初設(shè)計(jì)了一種基于比色法信號(hào)輸出的 wFDCF 傳感器，由三層皮膚安全材料制成的有機(jī)硅彈性體逐層組裝而成，F(xiàn)DCF 反應(yīng)傳感器嵌入其中，組裝好的傳感器具有合適的彈性和柔韌性以支持可穿戴設(shè)計(jì)。液態(tài)樣本在最上層的入口進(jìn)入后通過毛細(xì)管作用快速進(jìn)入反應(yīng)室。合成生物學(xué)的電路傳感器輸出采用 LacZ β-半乳糖苷酶操縱子，其能夠水解氯酚紅-β-d-半乳糖苷（CPRG），當(dāng)暴露于靶標(biāo)后會(huì)發(fā)生黃到紫色的變化。通過這樣的巧妙設(shè)計(jì)，研究團(tuán)隊(duì)測試了不同的傳感器模型，用于檢測小分子或病毒 RNA（圖 1）。
圖 1：比色法信號(hào)輸出的 wFDCF 傳感器設(shè)計(jì)示意圖
隨后，研究團(tuán)隊(duì)深入繼續(xù)深入該傳感器的檢測靈敏度和適用范圍，將其應(yīng)用于日常穿戴的紡織物中，并開發(fā)基于熒光檢測信號(hào)輸出的檢測體系，此項(xiàng)工作的第一步，便是篩選出更加適合的 FDCF 傳感器紡織品載體。
篩選實(shí)驗(yàn)流程簡介
1 先將 103 種織物樣本預(yù)處理，包括去除顆粒、洗滌等，每種織物分為 BSA 封閉處理和未處理兩組，干燥處理后用打孔器制成 2mm 的樣本，每個(gè)樣本設(shè)置三個(gè)重復(fù)，移入 384 孔板底部，對(duì)照組選擇 Whatman No.4 號(hào)濾紙。
2 隨后每孔內(nèi)加入等量的包含 0.6mg/mL CPRG 的定制 LacZ 模板的 PURExpress 游離體外蛋白合成液，微孔板密封留孔后整板凍干。
3 凍干后的紡織物待測板子加入 ddH2O 水化至初始反應(yīng)體積。
4 使用 SynergyNEO 微孔板檢測儀在 37℃ 的條件下，對(duì)樣本 384 孔板進(jìn)行長達(dá) 12 小時(shí)的動(dòng)態(tài)比色反應(yīng)（OD420nm）檢測，用于評(píng)價(jià)每種紡織物的 FDCF 傳感器的合成生物學(xué)反應(yīng)效果。
數(shù)據(jù)處理和篩選結(jié)果
動(dòng)力學(xué)顯色反應(yīng)結(jié)束后在微孔板中可觀察到明顯的顯色反應(yīng)變化，SynergyNEO 和 Gen5 軟件能夠自動(dòng)生成每個(gè)樣本的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)果，用戶后續(xù)的參數(shù)統(tǒng)計(jì)和分析（圖 2）。通過 OD420 峰值吸收光強(qiáng)度、動(dòng)力學(xué)平均反應(yīng)速率、到達(dá)最大信號(hào)時(shí)間、滯后時(shí)間（LagTime）等動(dòng)力學(xué)參數(shù)聯(lián)合紡織物密度和自發(fā)熒光等參數(shù)，設(shè)計(jì)了篩選評(píng)分，最后研究團(tuán)隊(duì)選擇了使用 85% 的聚酯纖維和 15% 的聚酰胺纖維的織物用于后續(xù)的熒光和發(fā)光信號(hào)輸出傳感器的載體（圖 3）。
圖 2：SynergyNEO 用于篩選 FDCF 適配的紡織物結(jié)果
圖 3：wFDCF 比色紡織品篩選的歸一化功能評(píng)分結(jié)果
SynergyNEO 驗(yàn)證 CRISPR-wFDCF 用于 RNA 直接檢測的有效性
CRISPR 技術(shù)用于基因編輯領(lǐng)域已經(jīng)是非常成熟和熱門的技術(shù)，除了基因編輯，這項(xiàng)技術(shù)在分子檢測領(lǐng)域也是大放異彩，早在 COVID-19 爆發(fā)不久，CRISPR 領(lǐng)域大神華人科學(xué)家張鋒于 2020 年發(fā)表了使用 CRISPR 診斷工具檢測新型冠狀病毒 COVID-19 的 SHERLOCK 技術(shù)，詳細(xì)介紹了標(biāo)本提取和檢測的方案。隨后，馬薩諸塞州劍橋市的夏洛克生物科學(xué)公司（Sherlock Biosciences）獲得了美國食品和藥物管理局 (FDA) 的緊急使用授權(quán) (EUA)，用于檢測導(dǎo)致 COVID-19 的病毒的 SHERLOCK CRISPR SARS-CoV-2 試劑盒，這是 FDA 首次授權(quán)使用 CRISPR 技術(shù)。安捷倫的 BioTek SynergyNeo2 是當(dāng)時(shí)市場上唯一被批準(zhǔn)用于 SHERLOCK SARS-CoV-2 診斷測試的微孔板讀板機(jī)。
由于 SHERLOCK 技術(shù)具有靈敏度高，響應(yīng)速度快、單堿基對(duì)分辨率、凍干兼容性和面向任意 DNA/RNA 序列的可編程性等諸多優(yōu)點(diǎn)，該研究團(tuán)隊(duì)將此技術(shù)融入到 wFDCF 的設(shè)計(jì)中，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種可以檢測呼出氣溶膠中 SARS-CoV-2 的口罩，只需按下病毒外側(cè)的按鈕，啟動(dòng)傳感器內(nèi)三種不同的生物反應(yīng)，第一種反應(yīng)用于破壞新冠病毒的蛋白外殼，暴露其內(nèi)部的 RNA；第二個(gè)反應(yīng)是一個(gè)常溫 PCR 擴(kuò)增步驟，特異性擴(kuò)增新冠病毒的刺突蛋白 （S 蛋白） 的基因片段；最后第三個(gè)反應(yīng)使用基于 CRISPR-Cas13a 的 SHERLOCK 技術(shù)來檢測病毒的 S 基因，被激活的 Cas13a 將熒光-DNA 探針分子切成兩個(gè)更小的片段，在口罩內(nèi)部的 LAF 窗口會(huì)顯示出肉眼可見的條帶（圖 4）。
除此之外，研究團(tuán)隊(duì)還繼續(xù)開發(fā)了光纖網(wǎng)絡(luò)集成的 wFCDF 傳感器，能夠產(chǎn)生更客觀可靠的熒光數(shù)據(jù)信號(hào)，可以通過智能手機(jī)的 APP 實(shí)時(shí)查看該信號(hào)。
圖 4：口罩式用于檢測 SARS-Cov-2 的集成化可穿戴設(shè)備設(shè)計(jì)
為了驗(yàn)證這種融合了 SHERLOCK 技術(shù)的 wFDCF 的有效性，使用 SynergyNEO 測試了 CRISPR-Cas13a 系統(tǒng)直接檢測病毒 RNA 的效果。
檢測流程簡介
1 制備 A CRISPR-Cas13a-MRSA SHERLOCK RNA 紡織品冷凍干燥樣本：反應(yīng)體系包含可以被 Cas13a 切割的熒光探針底物 RNaseAlert，按前述操作轉(zhuǎn)入微孔板中并進(jìn)行冷凍干燥。
2 使用含有 20nM mecA RNA transcript trigger 的 ddH2O 水化處理微孔板中的冷凍干燥的紡織品生物傳感器。
3 將微孔板置入 SynergyNEO 中，在 30℃ 條件檢測熒光信號(hào)的動(dòng)力學(xué)變化 (Ex. 470 nm/Em. 528nm, 30mins)。
4 微孔板檢測結(jié)果和可穿戴設(shè)備的熒光顯色反應(yīng)進(jìn)行平行對(duì)比。
檢測結(jié)果分析
對(duì)可穿戴設(shè)備的熒光顯色成像結(jié)果的信號(hào)強(qiáng)度做均一化處理后，其動(dòng)力學(xué)曲線（圖 5 綠色曲線）和微孔板熒光強(qiáng)度曲線（圖 5 紅色曲線）一致，此結(jié)果提示基于此 Cas13a 酶體系的 wFCDF 傳感器的可穿戴設(shè)備平臺(tái)具有良好的病毒 RNA 檢測效果，除此。
圖 5：wFDCF CRISPR-Cas13a 生物傳感器直接檢測 RNA 的效果驗(yàn)證
SynergyNeo2 多功能微孔板檢測儀推薦
SynergyNeo2 是安捷倫微孔板檢測家族中的頂級(jí)旗艦款，不僅融合了 Synergy 家族獨(dú)特的 Hybrid 技術(shù)，具有獨(dú)立的光路，確保在所有檢測模式下均能獲得出色的性能。此外其配備帶寬連續(xù)可調(diào)的第四代四光柵系統(tǒng)，并搭載基于雙平行 PMT 檢測的超快速高靈敏濾光片光學(xué)模塊，并且支持 TRF 激光器檢測和 Alpha 激光器檢測。
SynergyNeo2 主要優(yōu)勢
檢測模式全面，包含連續(xù)波長吸收光、熒光強(qiáng)度檢測、化學(xué)發(fā)光檢測、FP、TRF、HTRF、TR-FRET、FRET、BRET、AlphaLISA 和 alphasgreen 檢測模式。
獨(dú)特Hybrid 光路：卓越的檢測性能保證
超快速：最高可配置 4 個(gè) PMT 用于超快測量
輔助檢測功能豐富：包含先進(jìn)的環(huán)境控制技術(shù)，溫控至 70°C（這項(xiàng)功能在包括本文提到的 SHERLOCK 在內(nèi)的恒溫 PCR 技術(shù)中非常重要）和變速振蕩，以支持活細(xì)胞分析。
自動(dòng)化對(duì)接友好：BioStack Neo 可提供無人值守的自動(dòng)化功能、高通量和條形碼標(biāo)記的濾光片模塊，可以簡化工作流程和降低出錯(cuò)率。
軟件功能強(qiáng)大：Gen6 軟件提供了全面的微孔板檢測儀控制、強(qiáng)大的數(shù)據(jù)分析功能和 LIMS 集成功能。
應(yīng)用范圍廣泛：涵蓋基礎(chǔ)研究到藥物發(fā)現(xiàn)的多個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用。
參考文獻(xiàn)
1. Wearable materials with embedded synthetic biology sensors for biomolecule detection. https://doi.org/10.1038/s41587-021-00950-3
2. SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. https://www.nature.com/articles/s41596-019-0210-2