膠原蛋白是一類含有至少 20 種在遺傳學(xué)上不同類型的分泌蛋白質(zhì)家族，主要擔(dān)任機體的結(jié)構(gòu)支撐功能，具有獨特的由三條多肽鏈（被稱為 a 鏈）組成的三螺旋構(gòu)型。從類型來說，可以分為Ⅰ型膠原、Ⅱ 型膠原、Ⅲ 型膠原、Ⅳ 型膠原等。其中Ⅰ型和 Ⅲ 型膠原蛋白主要存在于皮膚、肌腱、韌帶、關(guān)節(jié)等結(jié)締組織，是真皮層中最主要的膠原蛋白類型，也是目前醫(yī)美領(lǐng)域應(yīng)用最多的類型。

從來源來區(qū)分，膠原蛋白又可以分為動物源（天然）膠原蛋白和重組膠原蛋白。動物源膠原蛋白，如牛 I 型膠原蛋白、豬 I 型膠原蛋白等，是從動物組織中提取、分離及純化后得到的。而重組膠原蛋白，通常是在細菌、酵母或其他真核細胞中表達、提取、純化得到的。

膠原蛋白的應(yīng)用非常廣泛，如創(chuàng)面敷料、止血材料、注射填充材料等。

近幾年，膠原蛋白廣泛的應(yīng)用在醫(yī)療器械上。國家也出臺了一系列膠原蛋白相關(guān)的法規(guī)，指導(dǎo)膠原蛋白類醫(yī)械產(chǎn)品的注冊申報和質(zhì)量控制，例如《重組膠原蛋白（YY/T 1849-2022）》, 《重組人源化膠原蛋白（YY/T 1888-2023）》, 《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品膠原蛋白（YY/T 1805）》等。

國家藥監(jiān)局發(fā)布的重組膠原蛋白原材料評價指導(dǎo)原則中要求對重組膠原蛋白進行鑒別、純度和雜質(zhì)進行分析，包括分子量、等電點、氨基酸序列等，并對脫酰胺化、氧化、糖基化修飾和脯氨酸羥基化等翻譯后修飾進行充分鑒定。安捷倫推出了針對重組膠原蛋白分析表征的工作流程，包括基于不同液相色譜分離機理（離子交換色譜、反相色譜、疏水相互作用色譜、SEC 分子篩等）的膠原蛋白異質(zhì)性分析工作流程，基于毛細管電泳的工作流程，以及基于 LC/QTOF 的完整蛋白和肽圖分析工作流程。安捷倫完整高效的工作流程配合穩(wěn)定耐用的儀器系統(tǒng)和專業(yè)的技術(shù)支持服務(wù)，為醫(yī)療器械用戶的注冊與申報保駕護航。

膠原蛋白材料相關(guān)雜質(zhì)是指膠原蛋白材料異質(zhì)性，如肽鏈的截短或延長形式、修飾形式（去酰胺化、異構(gòu)體、二硫鍵錯配、糖基化、磷酸化等）、聚合體、多聚體等。不同液相色譜分離機理，能幫助我們看到更多雜質(zhì)信息，對膠原蛋白的純度研究更加充分。

使用 Agilent 1290 Infinity 超高效液相色譜系統(tǒng)聯(lián)用 6500 系列 Q-TOF 可對膠原蛋白進行表征分析，搭配 Agilent MassHunter BioConfirm 軟件可實現(xiàn)自動化的數(shù)據(jù)提取、解卷積和膠原蛋白分子量測定。

重組膠原蛋白氨基酸全序列確認(rèn)和翻譯后修飾的表征分析通常利用 LC/QTOF 技術(shù)平臺，采取自下而上的蛋白質(zhì)表征策略。酶切處理后的膠原蛋白在 LC/QTOF 中進行分離和質(zhì)譜檢測，得到各肽段混合物的色譜保留時間、MS 和 MS/MS 高分辨精確質(zhì)譜信息，經(jīng)專門開發(fā)的 BioConfirm 軟件處理后，可得到膠原蛋白氨基酸序列、序列覆蓋率以及每個肽段的鑒定結(jié)果，包括對翻譯后修飾進行相對定量分析。下圖展示了牛 I 型膠原蛋白中肽段 GVPGPPGAVGPAGK 上脯氨酸 P 發(fā)生羥基化修飾的相對定量結(jié)果，可以看出羥基化修飾發(fā)生在 3# 和 6# 脯氨酸上，因此能夠產(chǎn)生 2 個修飾，1 個修飾，0 個修飾共計 4 種情況。

在《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品膠原蛋白第 3 部分：基于特征多肽測定的膠原蛋白含量檢測液相色譜-質(zhì)譜法（YY/T 1805.3-2022）》中，介紹了使用液相-三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜（LC/QQQ）進行蛋白含量檢測的詳細方案。

通過 LC/QTOF 分析鑒定的特征肽段或者標(biāo)準(zhǔn)方法中確定的肽段，可通過上述流程在 LC/QQQ 平臺上開發(fā) MRM 定量分析方法，靈敏度更高，分析時間也大大縮短。安捷倫開發(fā)的膠原蛋白的定量方法中，膠原蛋白計 0.05mg/ml，約相當(dāng)于 0.05ug/ml 肽段含量，低于 YY/T 1805.3 所要求的 0.1ug/ml 標(biāo)準(zhǔn)曲線下限。線性范圍 0.05~100 mg/ml，R²為 0.998，曲線準(zhǔn)確度 86.9~113.4%。該方案靈敏度高，線性范圍廣，滿足不同醫(yī)療器械產(chǎn)品中膠原蛋白含量測定的要求。

安捷倫 Cytation 成像型多功能酶標(biāo)儀在經(jīng)典多功能酶標(biāo)儀的基礎(chǔ)上，整合了全自動顯微成像系統(tǒng)，為重組膠原蛋白質(zhì)量控制分析項目提供了強大的支持。其多功能酶標(biāo)儀檢測模塊可開展雜質(zhì)、污染物和添加劑項目中的外源性殘留 DNA（熒光法）、宿主細胞蛋白質(zhì)殘留檢測（ELISA）、殘留抗生素檢測（ELISA）、促炎性污染物檢測（ELISA）等多種實驗。同時，成像模塊能夠為生物學(xué)功能評價中涉及的細胞增殖、細胞粘附性、細胞遷移提供便捷的自動化檢測方案，并支持 GB/T 16886.1 中規(guī)定的遺傳毒性、致癌性以及細胞毒性等多種檢測項目。