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安捷倫惰性材料齊上陣，加碼 Native SEC-MS 分析
重組蛋白質(zhì)治療藥物（例如單克隆抗體 (mAbs)）的體積排阻色譜法 (SEC) 是檢測是否存在可能對安全性和有效性產(chǎn)生不利影響的大小異構(gòu)體的重要分析工具。SEC 通常使用非揮發(fā)性磷酸鹽緩沖液，這使得分離過程與質(zhì)譜 (MS) 不兼容。因此，峰鑒定需要進(jìn)行脫鹽（在線或離線）。實(shí)驗(yàn)已證明，由于非特異性相互作用，當(dāng)應(yīng)用于經(jīng)典的不銹鋼儀器/色譜柱配置時，與 MS 兼容的揮發(fā)性緩沖液（如乙酸銨）的分離度明顯低于磷酸鹽緩沖液。這些非特異性相互作用可通過使用生物惰性或生物兼容性流路來抵消。安捷倫應(yīng)用工程師近期工作顯示帶PEEK內(nèi)襯的 Agilent AdvanceBio SEC 色譜柱與 Agilent 1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)組合非常適合用于蛋白治療藥物的非變性 SEC/MS 分析。
為評估 SEC 流路中是否存在不銹鋼組件的影響，采用幾種系統(tǒng)或色譜柱組合對 mAb 樣品進(jìn)行分析。結(jié)果顯示磷酸鈉在所有測試組合中均提供了令人滿意的分離性能，HMW 物質(zhì)的回收率良好。當(dāng)用乙酸銨代替磷酸鈉并降低流動相離子強(qiáng)度時，在流路中存在不銹鋼組件的情況下，分離效果會受到不利影響。色譜柱硬件的影響使得不銹鋼色譜柱與作為流動相的乙酸銨配合使用時，幾乎無法檢出 HMW 物質(zhì)（如有）。當(dāng)安裝帶 PEEK 內(nèi)襯的色譜柱并使用 100 mM 乙酸銨運(yùn)行時，HMW 物質(zhì)重新出現(xiàn)。使用 50 mM 乙酸銨流動相（在 MS 靈敏度方面最有利）時，只有生物兼容性液相色譜系統(tǒng)與帶 PEEK 內(nèi)襯的色譜柱的組合（右下色譜圖）能夠檢出 HMW 雜質(zhì)，提供有用的結(jié)果。
圖 2. 使用不同流動相組成和不同惰性程度的硬件得到的曲妥珠單抗的 UV 280 nm SEC 色譜圖
圖 4 進(jìn)一步示出儀器對峰寬和拖尾的影響。當(dāng)應(yīng)用 1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)時，峰寬始終較小。將磷酸鹽流動相替換為與 MS 兼容的乙酸鹽后，峰拖尾也不會增加。另一方面，當(dāng)不銹鋼液相色譜系統(tǒng)上的流動相改變時，峰寬和拖尾都會受到嚴(yán)重影響。降低流動相的離子強(qiáng)度會放大這種效應(yīng)。
圖 4. 在使用 Agilent 1290 Infinity II 液相色譜系統(tǒng) (SST LC) 和 Agilent 1290 Infinity II 生物惰性液相色譜系統(tǒng)以及不同的流動相組成獲得的曲妥珠單抗和 NISTmAb 的 UV 280 nm SEC 色譜圖中觀察到的峰寬和拖尾
1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)與帶 PEEK 內(nèi)襯的 AdvanceBio SEC 色譜柱（使用乙酸銨）相結(jié)合的出色性能，為搭配Agilent 6545XT Q-TOF 直接進(jìn)行非變性 MS表征提供了可行性。為平衡色譜性能與 MS 靈敏度，選擇 100 mM 乙酸銨流動相。
圖 6 顯示了維布妥昔單抗（一種半胱氨酸偶聯(lián)的 ADC）的 SEC/UV/MS 分析結(jié)果。由于輕鏈和重鏈僅由非共價相互作用維持，因此如果使用傳統(tǒng)的反相變性條件進(jìn)行質(zhì)譜表征是很難獲得完整蛋白水平數(shù)據(jù)。使用Native SEC-MS進(jìn)行表征，解卷積的譜圖顯示了藥物分布和藥物/抗體比率 (DAR)，以及主要的糖型信息。
圖 6. ADC 維布妥昔單抗的 SEC/UV/MS。(A) UV 280 nm 色譜圖，以及 (B) 與單體峰相關(guān)的解卷積非變性質(zhì)譜圖，顯示藥物分布為 0 到 8 且 DAR 為 4
結(jié)論
當(dāng)使用非變性 SEC/MS 分析 蛋白治療藥物時，不能低估液相色譜儀器和色譜柱惰性的重要性。減少與流路中不銹鋼組件的非特異性相互作用，對于確保獲得足夠的色譜性能和 HMW 物質(zhì)的回收率至關(guān)重要。配備有 PEEK 內(nèi)襯的 Agilent AdvanceBio SEC 色譜柱在 Agilent Infinity II 生物液相與6545XT Q-TOF系統(tǒng)上，能夠?qū)崿F(xiàn)出色的非變性 MS 檢測。
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