美國(guó)flocel腦血管生理病理刺激反應(yīng)機(jī)制研究模型

flocel該多功能血管模擬系統(tǒng)是一種基于涂覆蛋白中空纖維管內(nèi)外側(cè)接種細(xì)胞或直接對(duì)接ren工血管、或真實(shí)血管,配套心臟脈動(dòng)流泵,可用來(lái)模擬腦血管/毛細(xì)血管/神經(jīng)血管/毛細(xì)血管-小靜脈等體外血管微環(huán)境系統(tǒng)，可以長(zhǎng)期培養(yǎng)。

腦血管生理病理刺激反應(yīng)機(jī)制研究模型

該系統(tǒng)原理機(jī)制
計(jì)算機(jī)程控的四通道脈動(dòng)流泵對(duì)3D結(jié)構(gòu)的中空纖維管及其上細(xì)胞施加脈動(dòng)等流(也可模擬流體jian切應(yīng)力)作用，該纖維由允許蛋白質(zhì)與纖維基質(zhì)疏水結(jié)合的材料制成。被設(shè)計(jì)成涂有適當(dāng)?shù)幕|(zhì)蛋白，例如纖連蛋白、膠原蛋白、明膠或其他在接種到纖維內(nèi)壁時(shí)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞附著的蛋白質(zhì)。纖維的管腔中和纖維管外側(cè)可以接種不同細(xì)胞，
也可以直接在心臟脈動(dòng)泵上對(duì)接ren工血管和真實(shí)血管來(lái)實(shí)現(xiàn)各種血管微環(huán)境模擬?？梢赃M(jìn)行長(zhǎng)期血管微環(huán)境動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。

該系統(tǒng)體外細(xì)胞培養(yǎng)模塊包含一種*的中空纖維，該纖維由允許蛋白質(zhì)與纖維基質(zhì)疏水結(jié)合的材料制成?？墒褂?/span> 70%乙醇/水潤(rùn)濕纖維以激活纖維并允許蛋白質(zhì)附著。細(xì)胞培養(yǎng)模塊的推薦應(yīng)用是在慢性流動(dòng)或和jian切應(yīng)力條件下培養(yǎng)內(nèi)皮等細(xì)胞。它們被設(shè)計(jì)成涂有適當(dāng)?shù)幕|(zhì)蛋白，例如纖連蛋白、膠原蛋白、明膠或其他在接種到纖維內(nèi)壁時(shí)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞附著的蛋白質(zhì)。也可以使用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基中的 10% FBS 溶液。以這種方式附著的內(nèi)皮細(xì)胞可以承受各種水平的可重復(fù)jian切應(yīng)力，以進(jìn)行長(zhǎng)達(dá) 28 天或更長(zhǎng)時(shí)間的長(zhǎng)期培養(yǎng)。當(dāng)在這些條件下生長(zhǎng)時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞的行為與在靜態(tài)培養(yǎng)中生長(zhǎng)時(shí)非常不同。內(nèi)皮細(xì)胞將平放，形成單層并朝向培養(yǎng)基流動(dòng)方向，形成緊密連接。在慢性jian切應(yīng)力下培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞被認(rèn)為是一個(gè)更生理的環(huán)境，更接近理想的體內(nèi)條件。

我們開發(fā)了一種使中空纖維壁透明的新方法，以便于對(duì)管腔中的細(xì)胞進(jìn)行成像。

美國(guó)flocel DIV-BBB模型（上圖）

小靜脈節(jié)段（上圖）

腦血管生理學(xué)的研究對(duì)于了解神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制和藥物的藥代動(dòng)力學(xué)至關(guān)重要。適當(dāng)?shù)捏w外模型通常不能代表體內(nèi)生理學(xué)。為了解決這些問(wèn)題，我們建議使用一種新的ren工血管系統(tǒng)，該系統(tǒng)密切模仿ren類腦血管系統(tǒng)的毛細(xì)血管和靜脈段，同時(shí)還允許對(duì)實(shí)驗(yàn)變量及其操作進(jìn)行廣泛控制。

系統(tǒng)的中空纖維內(nèi)外側(cè)可以接種細(xì)胞，配套的心臟脈動(dòng)流泵以及跨膜電阻測(cè)量?jī)x可用于體外仿真腦血管、毛血管各種血管模擬仿真等、

使用中空纖維技術(shù)，我們修改了現(xiàn)有的血腦屏障 (BBB) (DIV-毛細(xì)血管) 動(dòng)態(tài)ren工模型，以涵蓋腦循環(huán)系統(tǒng)的遠(yuǎn)端毛細(xì)血管后 (DIV-小靜脈) 段。該ren工腦血管系統(tǒng)由串聯(lián)連接到小靜脈段的?BBB 模塊組成。泵產(chǎn)生脈動(dòng)流，動(dòng)脈壓力供給系統(tǒng)。毛細(xì)管模塊的灌注液達(dá)到與原位觀察到的水平相當(dāng)?shù)?/span>jian切應(yīng)力、壓力和流速。內(nèi)皮細(xì)胞暴露于流動(dòng)和腔外星形膠質(zhì)細(xì)胞刺激允許形成具有與體內(nèi)相當(dāng)?shù)目鐑?nèi)皮電阻（TEER；> 700 ohm cm²）和蔗糖滲透性（< 1X10-u cm/sec）的高選擇性毛細(xì)血管 BBB .試圖重現(xiàn)小靜脈血流動(dòng)力學(xué)微環(huán)境特征的小靜脈模塊被介質(zhì)灌注，導(dǎo)致jian切應(yīng)力和管腔內(nèi)壓力水平低于毛細(xì)血管中的水平。由于細(xì)胞和血流動(dòng)力學(xué)因素的改變，小靜脈段的血管床比 BBB 的血管床更不嚴(yán)格（TEER<250 ohm="">1X10-4 cm/sec）。外腔ren腦血管平滑肌細(xì)胞用于復(fù)制小靜脈外腔細(xì)胞組成。

DIV-BBB與小靜脈節(jié)段相結(jié)合所提供的*特征將切實(shí)擴(kuò)展我們剖析和研究ren類腦血管網(wǎng)絡(luò)不同節(jié)段的生理和功能行為的能力。

圖 1 DIV 毛細(xì)血管模型的示意圖。 注意系統(tǒng)如何概括流變學(xué)和細(xì)胞學(xué)
相應(yīng)的體內(nèi)腦血管節(jié)段的特征

確定小靜脈 (n=19) 模塊以模擬體內(nèi)相應(yīng)腦血管節(jié)段的流變特性（跨壁壓力、流速和jian切應(yīng)力）[23]。對(duì)于本文所示的實(shí)驗(yàn)，流速在每分鐘 4.6 和 5.3 mL 之間。

請(qǐng)注意，當(dāng)流量先通過(guò)毛細(xì)管，然后通過(guò)小靜脈段時(shí)觀察到顯著的壓力降低（參見圖 1B）。我們的數(shù)據(jù)顯示，透壁壓力和jian切應(yīng)力與相應(yīng)的體內(nèi)觀察結(jié)果一致（見表 1）。

此外，計(jì)算機(jī)控制的泵送機(jī)制使我們能夠重現(xiàn)廣泛的灌注場(chǎng)景，每個(gè)場(chǎng)景都以不同水平的jian切應(yīng)力、腔內(nèi)壓力、搏動(dòng)率為特征，以重現(xiàn)心跳/分鐘。

體外毛細(xì)血管系統(tǒng)可以模擬體內(nèi)相應(yīng)血管節(jié)段的流變學(xué)特征

圖 2A 顯示了血流動(dòng)力學(xué)中發(fā)生的變化

與灌注有關(guān)的毛細(xì)血管和小靜脈段的剖面（透壁壓力和jian切應(yīng)力）。

請(qǐng)注意，灌注速率的增加決定了顯著

毛細(xì)血管段的jian切應(yīng)力 (dynes/cm2) 和壁內(nèi)壓力 (mmHg) 成比例增加（圖 2A - 左圖；紅點(diǎn)）。表 1 顯示了體內(nèi)和體外參數(shù)之間的比較。

在小靜脈段中測(cè)量的相應(yīng)jian切應(yīng)力和壁內(nèi)壓力的變化明顯不那么明顯（圖2A-左面板；藍(lán)點(diǎn)）。請(qǐng)注意（參見圖 2B），將毛細(xì)管模塊的管腔輸出連接到小靜脈的管道不會(huì)影響流動(dòng)的流變特性。這通過(guò)比較后毛細(xì)管段（后 CAP）與前靜脈（前 VEN）壓力值來(lái)顯示。因此，從血流動(dòng)力學(xué)的角度來(lái)看，這兩個(gè)模塊表現(xiàn)為一個(gè)連續(xù)的血管系統(tǒng)，但在體內(nèi)表現(xiàn)出不同的毛細(xì)血管和毛細(xì)血管后流變特征。

表 1 并排比較體外與體內(nèi)測(cè)量的流變參數(shù)

（圖1）

圖 2 DIV 毛細(xì)管-小靜脈系統(tǒng)的流變特性。 圖 A：毛細(xì)血管和小靜脈段在灌注方面的血流動(dòng)力學(xué)曲線。 面板 B：請(qǐng)注意，毛細(xì)管腔和小靜脈腔之間存在模塊間連接器并沒(méi)有改變流動(dòng)的流變曲線。 星號(hào)“*"表示毛細(xì)血管和小靜脈之間透壁壓的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異（n=4；p<0.05）。

（圖2）

圖 3 體外毛細(xì)血管和小靜脈血管床的并排比較。面板 A：注意與小靜脈（低 TEER）相比，毛細(xì)血管系統(tǒng)如何允許形成非常嚴(yán)格的血管床（高 TEER）。 （面板 B）。另請(qǐng)注意，在小靜脈水平的jian切應(yīng)力下建立的毛細(xì)血管段和暴露于毛細(xì)血管jian切應(yīng)力水平的 enules 模塊形成了相當(dāng)?shù)偷膰?yán)格屏障，這表明腔外星形膠質(zhì)細(xì)胞和高jian切應(yīng)力水平對(duì)于發(fā)展緊密的血管床是必要的（圖 C）TEER毛細(xì)血管和小靜脈模塊中的蔗糖滲透性相關(guān)性。 sigmoid 曲線象征著 TEER 和我們之前確定的滲透率之間的理想相關(guān)性 [55]。注意毛細(xì)血管（滲透性較低）和小靜脈（滲透性*）之間的 ≈ 2 個(gè)數(shù)量級(jí)的差異。毛細(xì)管模塊中形成的更嚴(yán)格的血管床可以根據(jù)辛醇-水分配系數(shù) (XlogP) 區(qū)分藥物滲透性，其選擇性明顯高于小靜脈（圖 D）。星號(hào)“*"表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異（n=4；p<0.05）。

流速和jian切應(yīng)力：

計(jì)算纖維管腔側(cè)jian應(yīng)力的公式為：

T = (4ηQ/πR3)
其中：

T = jian切應(yīng)力（達(dá)因/cm

²）
η = 粘度（達(dá)因秒/cm²）
Q = 流體流速（毫升/秒/纖維）
R = 內(nèi)半徑
含有 10% FBS 的細(xì)胞培養(yǎng)基的粘度約為 0.008 dyne sec/cm，
- 流體流速必須從 ml/min 轉(zhuǎn)換為 ml/sec，

- 模塊中有 19 根纖維，因此流體流量必須除以 19，
- 光纖內(nèi)半徑為 300μm (0.03 cm)，因此 R3 = 0.000027，
- 每根纖維 1 毫升/分鐘的流速 = 0.0167 毫升/分鐘，
20 毫升/分鐘的jian切應(yīng)力 = 3.95 達(dá)因/厘米

我們的技術(shù)超越Endohm細(xì)胞培養(yǎng)室和Transwell細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，但也能與它們兼容：

系統(tǒng)組成部分及功能參數(shù)：

1、中空纖維柱、ren工血管、真實(shí)血管

該纖維由允許蛋白質(zhì)與纖維基質(zhì)疏水結(jié)合的材料制成?？墒褂?/span> 70% 乙醇/水潤(rùn)濕纖維以激活纖維并允許蛋白質(zhì)附著。它們被設(shè)計(jì)成涂有適當(dāng)?shù)幕|(zhì)蛋白，例如纖連蛋白、膠原蛋白、明膠或其他在接種到纖維內(nèi)壁時(shí)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞附著的蛋白質(zhì)。纖維的管腔中和纖維管外側(cè)可以接種細(xì)胞

特點(diǎn)：

•可控的內(nèi)腔與管腔體積比

•緊湊的尺寸(只有2.75英寸長(zhǎng))

•電極內(nèi)置在盤盒中。

優(yōu)勢(shì)：

•與真實(shí)體內(nèi)的體積比相當(dāng)

•減少所需細(xì)胞的數(shù)量

•跨內(nèi)皮電阻（TEER）測(cè)量很容易執(zhí)行

•盤盒為一次性使用，無(wú)需重裝。

•成本低

規(guī)格（如果標(biāo)準(zhǔn)版不滿足，可定制）：

•疏水性的毛細(xì)管Accurel® PP Q3/2

•跨毛細(xì)管間孔隙: 0.2 µm

•中空纖維數(shù)量: 19根

•內(nèi)腔總內(nèi)容積: 0.0123 in3 = 0.202 cm3

•管腔的總內(nèi)表面積: 2.09 in2 = 13.5 cm2

•腔外空間的容積 (細(xì)胞外液ECS): 0.070 in3 = 1.15 cm3

•ECS中中空纖維的總面積: 3.50 in2 = 22.6 cm2

2、跨內(nèi)皮電阻測(cè)定組件（TEER Measurement System）

TEER 測(cè)量的特征

· 可同時(shí)測(cè)量多達(dá)四個(gè)模塊的阻抗和相角

· 用戶自定義頻率掃頻范圍為1hz - 5000hz，分辨率為0.1 Hz。

· 帶有自動(dòng)觸發(fā)器的用于樣品間隔記錄的定時(shí)功能

· 峰值與峰值的激發(fā)電壓在5 mV - 60 mV之間，分辨率為0.1 mV

· 將測(cè)試參數(shù)、時(shí)間戳和數(shù)據(jù)自動(dòng)保存到.xls或.csv文件中

· 跨內(nèi)皮電阻(TEER)測(cè)量

跨內(nèi)皮電阻（TEER）測(cè)定為血腦屏障的完整性提供了一個(gè)快速簡(jiǎn)捷的評(píng)價(jià)模型。該動(dòng)態(tài)體外血腦屏障模型有與體內(nèi)血腦屏障相近的跨內(nèi)皮電阻，可達(dá)到＞1000 Ω-cm²， 而與之相對(duì)，單層模型通常只有＜200 Ω-cm²。

特點(diǎn)
●跨內(nèi)皮電阻測(cè)定范圍：＞1000 Ω-cm²
●可在多重頻率下測(cè)定阻抗
●低電壓設(shè)定：大60mV
●可對(duì)4個(gè)裝置進(jìn)行自動(dòng)多重處理
●USB接口

3、四通道脈動(dòng)流泵-基于計(jì)算機(jī)程控的心臟脈動(dòng)流泵

Flocel四通道灌流泵模擬心臟的脈動(dòng)動(dòng)作。四元泵包含四個(gè)小型、易于配置的脈動(dòng)泵，能夠持續(xù)流過(guò)DIV-BBB模型。每個(gè)泵都是單獨(dú)控制的，允許進(jìn)行多達(dá)四個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)

特點(diǎn):

四個(gè)濾筒的流量和泵速是獨(dú)立控制的。

外部24 VDC墻壁插入式電源

系統(tǒng)從其軟件接收程序命令

好處:

該系統(tǒng)支持四個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。

它將保育箱內(nèi)的熱量降至

個(gè)線性致動(dòng)器的規(guī)格

泵速:0-100 BPM

流速:0.1–50毫升/分鐘，取決于客戶的規(guī)格

外部+24伏直流電源

功耗:7.5瓦

重量:5.8盎司

4、程控電腦軟件

Flocel系統(tǒng)用尸通過(guò)系統(tǒng)自簾的DIV-BBB 軟件包進(jìn)行操作， 為TEER和蠕動(dòng)泵的測(cè)試參數(shù)的動(dòng)態(tài)修改提供了一個(gè)直現(xiàn)的界面。TEER用戶界面顯示了原胎數(shù)據(jù)輸出、頻率、時(shí)間等參額選擇。蠕動(dòng)泵的用戶界面通過(guò)允許每個(gè)獨(dú)立的泵頭選擇流速和不同的正litE）皮形，簡(jiǎn)化了設(shè)置四個(gè)j刷刷霍j主通道的任務(wù)。

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