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無細胞蛋白表達
選擇細胞裂解物對活細胞中重組蛋白表達是很有用的，它們可以裂解真核細胞或細菌細胞，并去除蛋白質(zhì)中所有不需要表達的成分。這些裂解物可以與DNA模板和其他所需成分在試管中結合，進行蛋白質(zhì)的表達（1）。
Figure 1: Cell-free expression components and additives
Figure 2: Production of a target protein with living cells
優(yōu)勢
1. 無細胞反應很容易建立，僅需幾個小時就可以完成蛋白質(zhì)表達。這種方法可以用小規(guī)模（50-100微升）的反應快速完成反應條件的優(yōu)化，優(yōu)秀的條件能被線性放大到其所需的數(shù)量。
2. 總處理量?。簩τ诳扇苄缘鞍?，幾毫升的反應就可以得到毫克量的蛋白。
3. 作為一個開放的系統(tǒng)，許多成分（天然的和非天然的），均可以被添加到反應混合物中，如還原/氧化元素、分子伴侶、標記的氨基酸或去污劑。如此，蛋白質(zhì)可以直接用于核磁共振，也可將膜蛋白在新生狀態(tài)下重組到納米盤系統(tǒng)中，而無需任何人造去污劑（10-12）。
4. 真核細胞的裂解物能進行翻譯后修飾，如糖基化或磷酸化，并可將天然的細胞膜成分（如微粒體）插入膜蛋白（9）。
5. 通常可以在無細胞系統(tǒng)中進行活細胞毒性蛋白的表達，由于已經(jīng)去除了負責（功能）的細胞成分，所以不會受到如蛋白消化酶或DNA模板不穩(wěn)定的影響。
6. 多聚體蛋白和復合物都能被表達，且DNA模板滴定會影響不同亞基的比例。
劣勢
1. 如果蛋白質(zhì)需求量大或者蛋白質(zhì)表達低，無細胞表達會相當昂貴。因此，對于每一種蛋白質(zhì)，應在小規(guī)模實驗中評估可達到的產(chǎn)量，并計算放大的成本，這對來自真核生物更復雜的無細胞裂解物來說更應如此。
表1 不同無細胞表達系統(tǒng)的比較
應用
由于蛋白質(zhì)是在一個開放性的系統(tǒng)中表達的，與活細胞表達相比，無細胞表達使許多應用受益，包括：
·表達篩選：通過無細胞表達，您可以在兩天內(nèi)從DNA模板-甚至是多個平行應得到免疫印跡的結果，這使得該系統(tǒng)對于快速篩選多個構建體和反應條件更具吸引力。
·蛋白標記：開放式系統(tǒng)可以與標記的氨基酸相結合，例如生物素或熒光標簽。
·核磁共振：可以很容易地將同位素標記的氨基酸添加到混合物中，獲得準備用于核磁共振的蛋白質(zhì)。
·結晶：與硒代蛋氨酸結合，在一個簡單的步驟中獲得蛋白質(zhì)重金屬衍生物。
Figure 2: Production of a target protein with living cells
膜蛋白特殊的適應性
由于蛋白質(zhì)是在一個開放的系統(tǒng)中表達的，與活細胞表達相比，無細胞表達促進了許多應用，包括：
·不溶性表達：在不添加任何種類的脂質(zhì)或去污劑的情況下，形成膜蛋白聚集體，在諸多情況下可以重新折疊成功能蛋白。
·去污劑：尤其是Brij系列的去污劑，多數(shù)情況下將其加入以溶解膜蛋白。如果需要，可以在后續(xù)步驟中交換去污劑，但需要是在純化過程中。(2-7)
·納米磷脂盤：在無細胞反應中加入納米磷脂盤，是獲得穩(wěn)定性蛋白質(zhì)簡單和簡便的方法，不需要去污劑，可用于各種檢測（10-15）。其應用范圍包括生物物理學分析、表面等離子共振、核磁共振和冷凍電鏡的質(zhì)譜分析。最近有研究表明，通過納米磷脂盤，膜蛋白在無細胞裂解物中的表達可通過中觀方法進行結晶（14），了解更多關于納米磷脂盤的信息。
·脂質(zhì)體和其他脂質(zhì)顆粒：如脂質(zhì)體、微粒體和其他含脂質(zhì)的結構（如雙層膜微胞），已被添加到無細胞反應中，尤其是與昆蟲細胞裂解物結合進行膜蛋白的表達（9）。使用適量的去污劑，還可以將膜蛋白從納米磷脂盤轉(zhuǎn)移到雙層膜微胞中（13）。
間歇式和無細胞持續(xù)交換方法
通常可按兩種方法進行無細胞反應：
1. 間歇式：可以輕松的在簡易管中進行間歇式無細胞反應，如離心管。其反應時間很短（1-3小時），因為能量物質(zhì)很快就被消耗完了，而最終產(chǎn)物的積累會減緩酶促反應的速度，因此蛋白質(zhì)的產(chǎn)量通常會很低。
2.無細胞持續(xù)交換或半透膜：無細胞持續(xù)交換（CECF）反應是通過半透膜進行的，所以可向反應提供能量物質(zhì)，并去除最終產(chǎn)物，如ADP。如此，反應時間就可以達到24小時，對于表達量高的可溶性蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)每毫升的產(chǎn)量可以達到幾毫克（8）。
References:
1. Endo, Y. et al. (eds) Cell-Free Protein Production, Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology vol. 607 (2010)
2. Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. "The Dependence of Cell- Free Protein Synthesis in E. Coli Upon Naturally Occurring or Synthetic Polyribonucleotides". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (10): 1588–1602 (1961)
3. Roos, C. et al. Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E.coli MraY translocase. Biochim. Biophys. Acta 1818; 3098-3106 (2012)
4. Proverbio, D. et al. Functional properties of cell-free expressed human endothelin A and endothelin B receptors in artificial membrane environments. Biochim. Biophys. Acta 1828, 2182-92 (2013)
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9. Suzuki, T. et al. An insect cell-free system for recombinant protein expression using cDNA resources. Methods in molecular biology vol. 577 (2009): 97-108.
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11. Hein, C. et al. Hydrophobic environments in cell-free systems: Designing artificial environments for membrane proteins. J. Eng. Life Sci. 14, 365-79 (2014)
12. Proverbio, D. et al. Membrane protein quality control in cell-free expression sysems: Tools, strategies and case studies. Membrane proteins production for structural analysis (Isabelle Mus-Veteau, ed.) Springer Heidelberg. ISBN:978-1-4939-0662-8.
13. Haberstock, S. et al. A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems. Prot. Exp. Purific. 82, 308-16 (2012)
14. Matthies, D. et al. Cell-free expression and assembly of a macromolecular membrane protein complex. J. Mol. Biol. 413, 593-603 (2011)
15. Schneider, B. et al. Membrane protein expression in cell-free systems. Metho. Mol. Biol. 601, 165-86 (2010)
16. Laguerre, A. et al. From nanodiscs to isotropic bicelles: A procedure for solution nuclear magnetic resonance studies of detergent-sensitive integral membrane proteins. Structure 24, 1-12 (2016)
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19. Schwarz, D. et al. Preparative scale expression of membrane proteins in E.coli based continuous exchange cell-free systems. Nat. Protocols 2, 2945-57 (2007)
