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Cube Biotech Rho1D4-專用于膜蛋白的抗體
Rho1D4是指牛視紫紅質(zhì)的細胞內(nèi)C末端的最后9個氨基酸，它是由與該序列特異性結合的單克隆抗體而命名的。通過與Rho1D4抗體結合，此序列可作為一種高特異性的純化標簽用于膜蛋白的純化。采用分子生物學方法將目的膜蛋白的C末端加上Rho1D4標簽（圖1），具有該序列的目的蛋白可被載有rho1D4抗體的親和基質(zhì)特異性結合，隨后目的蛋白可通過添加過量的Rho1D4肽與基質(zhì)抗體競爭性結合被洗脫下來，這種洗脫條件比改變pH更加溫和。
圖1：具有3個跨膜結構域的假設膜蛋白，將序列為TETSQVAPA的Rho-1D4標簽添加至其C末端。
Rho1D4系統(tǒng)介紹
20世紀80年代對Rho1D4表位和抗體進行了表征，并通過將抗體與Sepharose®珠子偶聯(lián)來純化猴腎細胞中表達的牛視紫紅質(zhì)。此后，Rho1D4系統(tǒng)（標簽，抗體偶聯(lián)親和基質(zhì)，洗脫肽）被用于個別膜蛋白的研究，包括G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），ATP結合轉(zhuǎn)運蛋白，溶質(zhì)反轉(zhuǎn)運蛋白和四跨膜蛋白。該系統(tǒng)的一個優(yōu)點是抗體-表位相互作用的高度特異性，而表位的序列和鏈長對于和抗體的結合是至關重要的。例如，用去除單個甲基的甘氨酸替代第三個丙氨酸可破壞二者的結合。同樣，完整的9個氨基酸標簽與Rho1D4抗體的結合緊密，去除2個氨基酸可破壞二者結合。因此，那些含有與Rho1D4表位相似序列的蛋白質(zhì)的與抗體的非特異性結合可被降低，純化到的蛋白都有較高的純度（表格1）。
第1步：結合。將帶Rho1D4標簽的蛋白質(zhì)與載有Rho1D4抗體的瓊脂糖孵育，從裂解物中純化目的蛋白。
第2步：洗滌。洗去雜蛋白和其他裂解物組分，只保留目的蛋白結合在親和基質(zhì)上。
第3步：洗脫。過量的Rho1D4肽競爭性地結合基質(zhì)，靶蛋白被洗脫在洗脫液里。
Rho1D4系統(tǒng)的優(yōu)點
Rho1D4系統(tǒng)的另一個優(yōu)點是較高的目的蛋白回收率。包括細菌，酵母和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)，已選擇性的對一些GPCR和其他膜蛋白進行了優(yōu)化。用Rho1D4系統(tǒng)純化膜蛋白后可通過凝膠過濾層析或離心濃縮來除去洗脫肽。在所有表達系統(tǒng)中，蛋白質(zhì)的產(chǎn)量都能達到毫克級別（表1）。純化的蛋白質(zhì)可用于功能研究，如配體結合的鑒定以及蛋白質(zhì)間的相互作用。例如，將標記的ABCA4固定在裝有Rho1D4抗體的基質(zhì)上，以鑒定其對天然配體（即視網(wǎng)膜的加合物）的親和力，然后通過添加ATP來釋放。將CD81蛋白整體固定在涂有Rho1D4抗體的平板上，它表現(xiàn)出和分離可溶蛋白片段與丙型肝炎病毒包膜E2蛋白相同的親和結合力。另外還可通過SPR和放射性標記分析CB2與配體結合，或?qū)?/span>CB2重構進脂質(zhì)體的進行G蛋白活化的測定。另外，有陰離子轉(zhuǎn)運載體AE1結構域的重組蛋白被標記且用Rho1D4系統(tǒng)純化后表現(xiàn)出與紅細胞來源的AE1蛋白有相同的硫酸外排速率。
蛋白 | 表達系統(tǒng) | 純度 | 產(chǎn)量（回收的總蛋白質(zhì)） | 采用的純化方法 |
hCB2G蛋白偶聯(lián)受體14 | 大腸桿菌 | 90％ | 4.5mg / 5L培養(yǎng)物 | Rho1D4 IAC + IMAC |
hVN1R1 G蛋白偶聯(lián)受體9 | 誘導型HEK293S | 90％ | 1毫克/ 1克細胞 | Rho1D4 IAC + SEC |
FPR3 G蛋白偶聯(lián)受體8 | 誘導型HEK293S | 90％ | 2毫克/ 6克細胞 | Rho1D4 IAC + SEC |
TAAR5 G蛋白偶聯(lián)受體7 | 誘導型HEK293S | 90％ | 1毫克/ 9克細胞 | Rho1D4 IAC + SEC |
OR131-2 G蛋白偶聯(lián)受體5 | 誘導型HEK293S | 90％ | 2.9毫克/ 10克細胞 | Rho1D4 IAC +離心 |
hOR17-4 G蛋白偶聯(lián)受體11 | 誘導型HEK293S | 90％ | 7.5mg / 2.5L培養(yǎng)物 | Rho1D4 IAC + SEC |
hOR17-4 G蛋白偶聯(lián)受體12 | 無細胞小麥胚芽 | 70％ | 0.3 mg / mL反應溶液 | Rho1D4 IAC + SEC |
CD81 Tetraspanin膜蛋白3 | 誘導型HEK293S | 95％ | 26微克/ 3×10 ^ 7個細胞 | Rho1D4 IAC |
AE1溶質(zhì)載體6 | 釀酒酵母菌株BJ5457 | 93％ | 2.5mg / 18L培養(yǎng)物 | Rho1D4 IAC |
表1.文獻中報道的用rho1D4系統(tǒng)純化的膜蛋白的純度和產(chǎn)率的實例。盡管用Rho1D4系統(tǒng)純化的許多蛋白質(zhì)都是G蛋白偶聯(lián)受體，但該系統(tǒng)也適用于純化其他膜蛋白（如轉(zhuǎn)運蛋白）。IAC：免疫親和層析; IMAC：固定化金屬親和層析; SEC：分子排阻色譜。
Rho1D4系統(tǒng)入門
由于在異源宿主中表達時，不同的蛋白對于去垢劑及純化柱的反應各不相同，所以在使用rho1D4系統(tǒng)純化膜蛋白時需要對一些實驗方法進行優(yōu)化，那么找到所有必須的步驟并制定出優(yōu)秀的實驗方案顯得尤為重要。以下4個步驟可幫助您快速有效地運用rho1D4系統(tǒng)純化目的蛋白。如果需要我們幫助您進行優(yōu)化，請與我們聯(lián)系。
第一步，您的目標蛋白需要與Rho1D4標簽融合，您可以將此標簽帶在目的蛋白C-或N-末端，建議選擇對蛋白質(zhì)活性影響很小的位置。
第二步，原核和真核系統(tǒng)在表達目的蛋白時具有不同的優(yōu)勢，需要進行反復試驗篩選優(yōu)秀的表達條件以找到合適的表達系統(tǒng)。在細菌系統(tǒng)（大腸桿菌）表達蛋白質(zhì)需要對宿主，培養(yǎng)基，溫度以及誘導時間的進行優(yōu)化。
第三步，去垢劑用于溶解膜蛋白，選擇優(yōu)秀的去垢劑對目標蛋白后續(xù)的純化至關重要?？蓪Ω鞣N常用去垢劑進行篩選。
第四步，純化Rho1D4標記的蛋白質(zhì)時，需要與Rho1D4抗體偶聯(lián)的親和基質(zhì)和競爭性洗脫用的Rho1D4肽。
我們提供PureCube Rho1D4瓊脂糖和Rho1D4肽，您可根據(jù)需求一起購買或單獨購買。對于Western Blots中目的蛋白的檢測，我們也可提供高特異性的Rho1D4抗體。
