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NTA vs. IDA：NTA和IDA的區(qū)別和選擇
如果您正在使用固定化金屬親和層析（IMAC）純化蛋白，您使用的金屬離子很可能是通過次氮基三乙酸（NTA）或者亞氨基二乙酸(IDA)偶聯(lián)到樹脂基質(zhì)上的。在眾多可用于IMAC的螯合配體中，NTA和IDA是常用的兩種。您更傾向于使用哪種螯合配體？您為何選擇該配體？這兩種配體有什么不同?為了幫助我們的客戶在充分了解產(chǎn)品的情況下做出訂購決定，我們以PureCube Ni-NTA 瓊脂糖和PureCube Ni-IDA 瓊脂糖為例，詳細介紹二者的異同。
兩種配體在結(jié)構(gòu)上和化學(xué)上有何不同？
螯合配體如何影響蛋白結(jié)合載量？
金屬離子在瓊脂糖的親和能力和特異性中扮演什么角色？
NTA和IDA對氧化劑的反應(yīng)如何？
樣品緩沖液中的螯合劑對NTA和IDA的影響有無不同？
NTA vs IDA: 兩個配體的說明
固定化金屬親和層析（IMAC）是一種常用的蛋白純化方法，尤其是純化帶多聚組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白。過渡金屬離子通過螯合配體被固定在基質(zhì)上，金屬離子能與多聚組氨酸標(biāo)簽相互作用，有效地將帶標(biāo)簽的重組蛋白從樣品中純化出來。目前商品化的瓊脂糖中常用的兩種配體便是NTA和IDA。在這份使用說明中，我們從已發(fā)表文章和實驗中總結(jié)了兩種配體的區(qū)別以及優(yōu)缺點，以便為您提供一些思路，使您選擇的瓊脂糖能得到優(yōu)秀的純化結(jié)果。
利用金屬捕獲蛋白質(zhì)
固定化金屬親和層析（IMAC）解決通常的一步蛋白純化
從1975年IMAC問世以來，IMAC以及它的變型和改良技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于蛋白純化領(lǐng)域。通常情況下，過渡金屬離子通過配體固定在基質(zhì)上，與融合在肽段C-或N-末端的多聚組氨酸標(biāo)簽（由3-10個組氨酸組成）上的咪唑基相互作用。這種相互作用可以有效地將蛋白質(zhì)從溶液中分離出來，然后通過一定濃度梯度的咪唑洗脫液、改變pH或金屬螯合將結(jié)合的蛋白從金屬離子上洗脫下來。
IMAC的初始用于純化自身具有金屬離子親和性的天然蛋白質(zhì)，現(xiàn)在已擴展到純化磷酸化蛋白，抗體以及一系列帶有多聚組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。多聚組氨酸標(biāo)簽的突出優(yōu)點在于它的體積較小，同時免疫原性很低，幾乎不會干擾到蛋白質(zhì)的正常功能。三價或四價離子通常用于磷酸化蛋白的純化，而二價離子如Ni2+, Cu2+ 和 Zn2+一般用于純化帶組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白。
IMAC之所以能得到廣泛應(yīng)用，不僅因為它價格低廉，操作簡單，還因為它非常穩(wěn)定，在很多特殊的蛋白純化情況中也可以使用。例如，我們需要在非變性或變性條件下純化蛋白，或者在氧化及還原環(huán)境中純化蛋白，都可以使用IMAC。另外，IMAC可耐受多種化學(xué)物質(zhì)。總而言之，IMAC還具有高親和性，高特異性和易放大性，這使得蛋白純化甚至是從粗裂解液中純化都變得非常有效。
不僅僅是蛋白純化
IMAC作為一種通用技術(shù)，其應(yīng)用之廣，非常驚人。表面固定化組氨酸標(biāo)記抗原可增加以ELISA為基礎(chǔ)的診斷工具的靈敏度。IMAC也可以介導(dǎo)功能域表面蛋白與蛋白相互作用的研究。在蛋白組學(xué)研究中，IMAC可用于預(yù)分離階段來減少對象樣品的復(fù)雜性。最后，利用螯合原理，樣品與耦聯(lián)螯合配體的基質(zhì)一同孵育，配體可減少PCR的金屬離子抑制劑，因此能快速產(chǎn)生用于擴增的樣品。
選擇螯合配體：選擇哪一種？
配體的配位數(shù)對洗脫蛋白的產(chǎn)量和純度有影響
Porath和同事發(fā)明了第一個IMAC瓊脂糖實物，他們將金屬離子通過亞氨基二乙酸（IDA）固定到瓊脂糖上。現(xiàn)在商品化IMAC瓊脂糖仍廣泛使用IDA配體，次氮基三乙酸（NTA）在1987年被Hochuli和同事引入商品化IMAC中。在那之后，盡管有其他專用螯合配體(例如 TED, TALON®)陸續(xù)問世，但IDA和NTA一直代表常用的親和純化蛋白IMAC瓊脂糖。從結(jié)構(gòu)上看，IDA與NTA的區(qū)別在于NTA多了一個羧甲基基團。從化學(xué)性質(zhì)上看，額外的功能基團使得NTA與金屬離子的配位能力更強，因為NTA擁有四個效價，而IDA只有三個（圖1）。
圖1：IMAC螯合配體IDA和NTA. IDA和NTA廣泛用于將過渡態(tài)金屬離子結(jié)合到基質(zhì)上，該整體可作為親和樹脂。這兩種配體與金屬離子結(jié)合的價態(tài)數(shù)目不同（IDA是三價而NTA是四價；價態(tài)用橙色標(biāo)出），這會影響純化到的蛋白的質(zhì)量。
當(dāng)兩種配體都有兩個價位可以與組氨酸殘基的咪唑基相互作用時，配位數(shù)對純化到的蛋白質(zhì)量有影響。首先，作為一個三價配體（配位數(shù)為3），IDA的金屬離子漏出率很高，尤其是在平衡和洗脫步驟。盡管NTA瓊脂糖的洗脫成分中也含有部分漏出的金屬離子，但明顯少于IDA樹脂。第二，由于目標(biāo)蛋白性質(zhì)的變化，用IDA瓊脂糖純化的帶組氨酸標(biāo)簽的蛋白通常比用NTA瓊脂糖純化的純度低。圖2顯示在大腸桿菌中表達的綠色熒光蛋白，分別用PureCube Ni-IDA和PureCube Ni-NTA純化后的SDS-PAGE圖。IDA瓊脂糖純化的前三個洗脫成分中有清晰的非目的蛋白的裂解產(chǎn)物蛋白條帶。
圖2：在大腸桿菌中表達的綠色熒光蛋白，分別用PureCube Ni-IDA和PureCube Ni-NTA純化后的SDS-PAGE圖
然而，IDA也有其自身優(yōu)勢，配有IDA配體的瓊脂糖通常價格稍低一些。另外，三價配體在洗脫蛋白時需要的咪唑溶液濃度比四價的NTA低。最后，IDA分子更小，可以更高的密度結(jié)合到基質(zhì)上，因此能結(jié)合更多的金屬離子。通常來說，低裝載密度可提高目的蛋白純化質(zhì)量降低目的蛋白純化產(chǎn)量；而高裝載密度可提高目的蛋白產(chǎn)量，但會增加非特異性結(jié)合。綜合考量IDA或NTA的裝載密度與不同金屬離子的親和性和特異性（圖3），可以提高特定蛋白的純化產(chǎn)量及質(zhì)量。
圖3：IMAC常用金屬離子的相對親和性和特異性。一方面，銅親和力高從而純化蛋白產(chǎn)量高，但是特異性較低。另一方面，鈷親和力較低但特異性高，從而能減少洗脫液中非目的蛋白。
那么我們應(yīng)該如何根據(jù)不同的蛋白選擇適合的配體和金屬離子呢，下期我們將詳細為您解答，敬請關(guān)注！
蛋白決定配體和金屬離子
當(dāng)被問及為何選擇某種配體來純化帶組氨酸標(biāo)簽的蛋白而不選擇另外一種時，大多數(shù)研究者都沒有明確的答案。然而，在純化過程中我們應(yīng)該嘗試使用多種配體，因為IMAC瓊脂糖結(jié)合蛋白的能力與金屬離子的種類和被純化蛋白的性質(zhì)密切相關(guān)，改變配體-離子組合有可能得到更好的純化效果。例如，通常IDA的金屬離子容量比NTA高（PureCube IDA 瓊脂糖Ni2+ 或 Cu2+濃度>25 μmol/mL，而PureCube NTA 瓊脂糖Ni2+ 或 Cu2+濃度>15 μmol/mL）。理論上說，IDA有更多的蛋白結(jié)合位點，蛋白產(chǎn)量應(yīng)該更高，正如表1中的JNK1 和GFP，但是不同的蛋白具有不同的結(jié)合能力，所以有時產(chǎn)量可能會極低，例如白介素-1β。另外即便是對于同一個帶組氨酸標(biāo)簽的蛋白，結(jié)合了不同金屬離子的瓊脂糖對其的親和性也是不同的。鈷的結(jié)合特異性高但親和性低（圖3），我們可以看到結(jié)合鈷的瓊脂糖蛋白載量更低（表1）。鎳的特異性低而親和性高，因此蛋白產(chǎn)量明顯更高。我們可以通探索不同的金屬離子和配體組合來優(yōu)化帶組氨酸標(biāo)簽蛋白的純化方法。不過需要注意的是，對所有的樹脂或所有的蛋白質(zhì)來說，上述的趨勢并不是一成不變的。
表1：IMAC瓊脂糖的結(jié)合能力很大程度上取決于金屬離子和被純化蛋白的性質(zhì)。對不同蛋白進行PureCube組氨酸親和瓊脂糖的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制測試。某些蛋白如GFP和JNK1產(chǎn)量高，而其他蛋白如白介素1β的產(chǎn)量較低。同時，瓊脂糖上裝載的金屬離子也影響結(jié)合能力。首先，鈷的蛋白結(jié)合特異性比鎳高，導(dǎo)致總體上較低的產(chǎn)量。其次，鈷與JNK1的相互作用比GFP強，而鎳剛好相反。
你的樣品中還有什么？
它會影響你選擇的標(biāo)準(zhǔn)
被研究樣品中的某些化合物的存在會影響IDA-瓊脂糖和NTA-瓊脂糖的結(jié)合能力。DTT（二硫蘇糖醇）是一種還原劑，可保護蛋白質(zhì)的游離巰基不被氧化，破壞SDS-PAGE的樣品中的二硫鍵。DTT可還原IMAC瓊脂糖的金屬離子，通常會使瓊脂糖的顏色變?yōu)樽厣?。通過實驗比較發(fā)現(xiàn)，PureCube Ni-IDA 瓊脂糖和 PureCube Ni-NTA 瓊脂糖暴露在不同濃度的DTT溶液中時，兩種瓊脂糖的結(jié)合能力呈非線性比例下降，隨DTT濃度的增加，Ni-NTA表現(xiàn)出較慢的下降速率，為8%，而Ni-IDA為11.1%。10 mM DTT下Ni-NTA 和 Ni-IDA的結(jié)合能力總體下降為22%和30%。（圖4A）
EDTA對于結(jié)合能力的影響更為顯著。許多緩沖液中有這種六價螯合劑來減少金屬離子的干擾。我們的對照實驗顯示較高濃度EDTA中Ni-NTA比Ni-IDA更有活力。Ni-NTA的結(jié)合能力呈非線性降低，EDTA濃度達到1mM時總體下降了46%，之后略微下調(diào)。在EDTA濃度達到1mM前, Ni-IDA的結(jié)合能力下降幅度與Ni-NTA相似。然后結(jié)合能力劇烈下降。（總降低量：65%，圖4B）
圖4： Ni-NTA比Ni-IDA更能耐受還原劑和螯合劑，將PureCube Ni-NTA瓊脂糖和PureCube Ni-IDA瓊脂糖分別置于三種濃度的DTT(A)和EDTA(B)溶液中處理1h，然后分別用含有上述瓊脂糖的重力柱純化帶組氨酸標(biāo)簽的GFP。兩種瓊脂糖的蛋白結(jié)合能力都下降，但Ni-NTA在兩種試劑處理后下降更為緩慢，尤其是在高濃度DTT和EDTA處理后。我們也觀察到PureCube Ni-NTA瓊脂糖在有DTT時沒有變成棕色（A的插圖）。誤差線為初次標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）
NTA vs. IDA：做出正確的選擇
決定用何種IMAC瓊脂糖進行蛋白純化時需考慮以下問題：
*你需要目的蛋白的純度是多高？
*你需要目的蛋白的產(chǎn)量是多少？
*你的樣品中是否含有如DTT或EDTA之類的化學(xué)試劑？
*你的預(yù)算是多少？
*你對蛋白表達量的預(yù)期是多少？
如果你追求高產(chǎn)量，而對蛋白純度的要求并不高，那么可以選用IDA-瓊脂糖。它價格較低，性能穩(wěn)定，易于再生以及再裝載金屬離子。為減少非特異性結(jié)合，可以嘗試使用其他金屬離子如鋅和鈷。如果對蛋白純度要求高的話（例如，為后續(xù)結(jié)晶做準(zhǔn)備），NTA-瓊脂糖是很好的選擇。通過裝載特異性高的金屬離子（如鈷）可進一步提高瓊脂糖的特異性。NTA-瓊脂糖的另一個優(yōu)點是對如DTT和EDTA之類試劑時有較高的耐受性，因此適用于多種樣品緩沖液。瓊脂糖種類的選擇也很重要，基質(zhì)和純化流程會影響最終的結(jié)果。另外，純化蛋白時使用過量的瓊脂糖會導(dǎo)致純度降低，因為很多結(jié)合位點沒有和目的蛋白結(jié)合而暴露。
當(dāng)純化少量蛋白時，我們推薦您使用磁珠作為基質(zhì)；磁珠更適合用于純化稀釋樣品中的蛋白、低表達量的蛋白及pull-down實驗。如果從中等規(guī)模培養(yǎng)物中提取蛋白（>50 μg）推薦選用瓊脂糖批量純化或用重力柱純化，瓊脂糖也可放大用于大量的蛋白的純化。而預(yù)裝層析柱可用于蛋白的自動純化，載量為1-100mg。（圖5）
總的來說，如果要優(yōu)化帶組氨酸標(biāo)簽蛋白的純化過程，需要嘗試多種親和瓊脂糖，但只要遵循一定的原則，IMAC瓊脂糖的考察和選擇也是一個系統(tǒng)化的過程。
圖5：不同形式的IMAC適用于不同的蛋白產(chǎn)量。一般來說，蛋白含量低的樣品推薦選用磁珠，大量蛋白的純化推薦選用瓊脂糖。標(biāo)出的蛋白量僅供參考。
這份說明的總結(jié)：
*IDA-瓊脂糖價格較低
*NTA-瓊脂糖洗脫下來的蛋白通常純度較高
*NTA-瓊脂糖的金屬離子漏出率明顯較低
*改變金屬離子可以改變瓊脂糖的結(jié)合特異性。Co2+ 離子特異性特別強，其次是Ni2+, Zn2+,最后是 Cu2+
*NTA-瓊脂糖抵抗還原劑和螯合劑的能力強
