熒光定量PCR（Real-time PCR），是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過對擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時檢測,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。那么你知道熒光定量PCR的原理是什么嗎？讓我們一起來看看吧！
以探針法熒光定量PCR為例：PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。開始時，探針完整地結(jié)合在DNA任意一條單鏈上，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收，檢測不到熒光信號；PCR擴(kuò)增時，Taq酶將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完quan同步。
傳統(tǒng)的PCR進(jìn)行檢測時，擴(kuò)增反應(yīng)后需要進(jìn)行染色處理及電泳分離，并且只能作定性分析，不能準(zhǔn)確定量，易造成污染出現(xiàn)假陽性，使其應(yīng)用受到限制。實(shí)時定量PCR技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對模板的定量，且具有靈敏度高、特異性和可靠性更好、自動化程度高和無污染的特點(diǎn)，使得熒光定量PCR逐漸取代常規(guī)PCR。
在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即是基線，這條線是可以自動生成也可以手動設(shè)置的。之后反應(yīng)會進(jìn)入指數(shù)增長期，這個期間擴(kuò)增曲線具有高度重復(fù)性，在該期間，可設(shè)定一條熒光閾值線，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般會將熒光閾值的缺省設(shè)置是 3-15 個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10 倍。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值，這個值與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系，且該值具有重現(xiàn)性。
Ct值最大的意義就是用來計算目的基因的表達(dá)量，此時就有兩個概念容易被提及，那就是絕對定量和相對定量，絕對定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說的拷貝數(shù)。相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數(shù)。
Ct值誠然可以被利用來計算這兩種定量結(jié)果，但是絕對定量實(shí)驗(yàn)必須使用已知拷貝數(shù)的絕對標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線。絕對標(biāo)準(zhǔn)品制作困難難以獲取，實(shí)驗(yàn)室基本都是選擇相對定量的方法來計算相對基因表達(dá)量。
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