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異硫氰酸熒光素

產(chǎn)品貨號(hào)：0633-1

儲(chǔ)存條件：4℃干燥避光保存，2年有效。

產(chǎn)品描述

FITC，英文全稱Fluorescein Isothiocyanate，中文名稱異硫氰酸熒光素，具有高吸收率、優(yōu)良的熒光量子產(chǎn)率和良好的水溶性等特點(diǎn)，是生物學(xué)中應(yīng)用最wei廣泛的一種綠色熒光素衍生物，其異硫氰酸基團(tuán)可與蛋白的氨基末端或者伯胺反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)包括抗體，凝集素在內(nèi)的蛋白標(biāo)記。

產(chǎn)品性質(zhì)

應(yīng)用

除了用作蛋白質(zhì)標(biāo)記物，還可用作蛋白質(zhì)熒光示蹤劑，標(biāo)記抗體用以快速鑒定病原體，以及用于蛋白質(zhì)和多肽（HPLC）的微量測(cè)序。FITC為黃-橙色粉末，最da激發(fā)波長(zhǎng)為494 nm。一旦激發(fā)，在最da發(fā)射波長(zhǎng)520 nm處呈黃-綠色熒光。

FITC有兩種異構(gòu)體，異構(gòu)體I（Isomer I）和異構(gòu)體II（Isomer II）,二者在光譜性質(zhì)上基本沒(méi)有差異（無(wú)論是波長(zhǎng)還是光強(qiáng)度），但是前者更易純化，所以相對(duì)便宜，應(yīng)用也較為廣泛。對(duì)于大部分應(yīng)用，混合型的FITC已能很好的滿足實(shí)驗(yàn)要求。本品Isomer I含量≥90%，適合用于蛋白質(zhì)標(biāo)記。

使用方法

1. 標(biāo)記蛋白

1）制備溶于0.1 M碳酸鈉緩沖液（pH 9）的待交聯(lián)蛋白樣品，濃度≥2 mg/mL。

【注】

a）勿將碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液存放于0-5℃超過(guò)1周，其pH值會(huì)發(fā)生變化，建議現(xiàn)配現(xiàn)用。

b）待標(biāo)記的蛋白必須是未被污染蛋白，且溶解蛋白的緩沖液里不能含有疊氮鈉或胺類試劑，如Tris、甘氨酸，因?yàn)檫@些試劑會(huì)抑制標(biāo)記反應(yīng)。如果緩沖液里含有上述試劑，則需將該蛋白溶液在4℃下于PBS，pH 7.4 透析過(guò)夜；透析過(guò)程中如果pH值過(guò)高（＞8.0-8.5）會(huì)損害某些蛋白。

2）溶解FITC于無(wú)水DMSO配制成濃度為1 mg/mL的溶液。

【注】于標(biāo)記實(shí)驗(yàn)前新鮮配置FITC溶液，避光。

3）對(duì)于1 mL 蛋白溶液加入50 µLFITC溶液，可按照每次5 µL的量邊加邊輕輕攪拌蛋白溶液；

4）待所需FITC加入完畢，將反應(yīng)液于4℃避光孵育8 h；

5）加入NH4Cl使其終濃度至50 mM，4℃終止反應(yīng)2 h；

6）加入二甲苯青至濃度0.1%，甘油至濃度5%；         

7）通過(guò)大小孔徑合適的凝膠過(guò)濾層析分離排除未被結(jié)合的FITC，分離范圍在20，000至50，000（球蛋白例如抗體）。待凝膠柱平衡后，將以上反應(yīng)混合液從柱頂注入，打開(kāi)凝膠柱，待其全部流入柱床后，加入PBS緩沖液。

此時(shí)，可以形成兩條帶：a，快速移動(dòng)帶，也就是FITC-蛋白偶聯(lián)物，先被洗脫，通常于室內(nèi)光下可看到；b，慢速移動(dòng)帶，也就是未結(jié)合蛋白的FITC和二甲苯青。僅僅在PBS緩沖液清洗后被洗脫出來(lái)。

8）于4℃避光儲(chǔ)存上述偶聯(lián)物，加入0.1%（w/v）疊dan化na作為一種防腐劑。若蛋白濃度較低（＜1 mg/mL），可加入1%BSA作為一種蛋白穩(wěn)定劑。

9）偶聯(lián)物中熒光素和蛋白的比值（F/P）可通過(guò)測(cè)定495 nm和280 nm處的吸光值來(lái)鑒定，F(xiàn)/P應(yīng)位于0.3-1.0。小于該比例則信號(hào)太低，高于該比例則背景太高。

2. 熒光素/蛋白摩爾比（F/P）的測(cè)定

F/P摩爾比即熒光素蛋白偶聯(lián)物中FITC與蛋白質(zhì)的摩爾比。為了計(jì)算該值，首先需測(cè)定該偶聯(lián)物在280nm和495nm的吸光值：將已標(biāo)記蛋白樣品置于石英比色皿中，測(cè)得A280和A495，2.1 對(duì)FITC-IgG標(biāo)記物

F/P摩爾比計(jì)算公式為：Molar F/P=[2.77×A495] / [A280-（0.35×A495）]

FITC-IgG偶聯(lián)物濃度計(jì)算公式為：IgG（mg/ml）=[A280-（0.35×A495）] / 1.4

【注】該處1.4，指的是大多數(shù)物種IgG 以濃度為1mg/ml在pH7.0的條件下測(cè)得的A280為1.4。

2.2 對(duì)于其他FITC-蛋白質(zhì)（非IgG）偶聯(lián)物

F/P摩爾比計(jì)算公式為

【注】

C對(duì)一種蛋白質(zhì)而言是一常數(shù)；MW是蛋白質(zhì)分子量；389是FITC的分子量；

195是FITC偶聯(lián)物在pH13, 490 nm處的吸光值E0.1%；

（0.35×A495）是基于FITC A280的校正因子；

E0.1%是某一蛋白（1.0 mg/mL）在280 nm處的吸光值。

注意事項(xiàng)

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

本產(chǎn)品僅作科研用途！