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二十六、雙向凝膠電泳（2-DE）

 

雙向凝膠電泳的原理是*向基于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開(kāi)。

二十七、mRNA的分離與純化（寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA）

真核細(xì)胞的mRNA分子zui顯著的結(jié)構(gòu)特征是具有5’端帽子結(jié)構(gòu)（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴。絕大多數(shù)哺乳類動(dòng)物細(xì)胞mRNA的3’端存在20-30個(gè)腺苷酸組成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。這種結(jié)構(gòu)為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標(biāo)志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎(chǔ)就在于此。

mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法zui為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特點(diǎn)，在RNA流經(jīng)寡聚（dT）纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當(dāng)逐漸降低鹽的濃度時(shí)或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經(jīng)過(guò)兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。

二十八、His-tag純化蛋白

His•Tag序列（6、8或10個(gè)連續(xù)的組氨酸殘基）與固定在基于NTA(氮川三乙酸鎳) -和IDA- 的His•Bind樹(shù)脂上的二價(jià)陽(yáng)離子Ni2+結(jié)合。洗去未結(jié)合蛋白后，用咪唑或稍低的pH洗脫并回收目標(biāo)蛋白。該通用系統(tǒng)使得可在溫和、非變性條件，或存在6M胍或尿素條件下純化蛋白。

二十九、RNA酶保護(hù)試驗(yàn)方法 (RNase Protection Assay，RPA)

RNA酶保護(hù)法是近十年發(fā)展起來(lái)的一種全新的mRNA定量分析方法。其基本原理是將標(biāo)記的特異RNA探針（32P或生物素）與待測(cè)的RNA樣品液相雜交，標(biāo)記的特異RNA探針按堿基互補(bǔ)的原則與目的基因特異性結(jié)合，形成雙鏈RNA；未結(jié)合的單鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待測(cè)目的基因與特異RNA探針結(jié)合后形成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化，故該方法命名為RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)。與Northern blot和RT-PCR比較，RPA有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1. 檢測(cè)靈敏度比Northern雜交高。由于Northern雜交步驟中轉(zhuǎn)膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而RPA將所有雜交體系進(jìn)行電泳，故損失小，提高了靈敏度。2. 由于PCR擴(kuò)增過(guò)程中效率不均一和反應(yīng)“平臺(tái)”問(wèn)題，基于PCR產(chǎn)物量進(jìn)行分析所得數(shù)據(jù)的可靠性將下降，而RPA沒(méi)有擴(kuò)增過(guò)程，因此，分析的數(shù)據(jù)真實(shí)性較高。3.由于與反義RNA探針雜交的樣品RNA僅為該RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA樣品仍可進(jìn)行分析。4.步驟較少，耗時(shí)短。與Northern雜交相比，省去了轉(zhuǎn)膜和洗膜的過(guò)程。5. RNA-RNA雜交體穩(wěn)定性高，無(wú)探針自身復(fù)性問(wèn)題，無(wú)須封閉。6. 一個(gè)雜交體系中可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)探針雜交，無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性問(wèn)題。7. 檢測(cè)分子長(zhǎng)度可以任意設(shè)置，靈活性大。RPA的缺點(diǎn)是需要同位素標(biāo)記探針。

三十、免疫組化

三十一、各種分子標(biāo)記技術(shù)的比較

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作為遺傳標(biāo)記,開(kāi)創(chuàng)了直接應(yīng)用DNA 多態(tài)性的新階段,是zui早應(yīng)用的分子標(biāo)記技術(shù) 。RFLP 是檢測(cè)DNA 在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定片段DNA的大小,反映DNA 分子上不同酶切位點(diǎn)的分布情況,因此DNA序列上的微小變化,甚至1 個(gè)核苷酸的變化,也能引起限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)的丟失或產(chǎn)生, 導(dǎo)致酶切片段長(zhǎng)度的變化。

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA (Randomamplified polymorphic DNA ,RAPD) 技術(shù),由于其*的檢測(cè)DNA多態(tài)性的方式使得RAPD 技術(shù)很快滲透于基因研究的各個(gè)領(lǐng)域。RAPD 是建立于PCR 基礎(chǔ)之上的分子標(biāo)記技術(shù),基本原理是利用一個(gè)隨機(jī)引物(8～10 個(gè)堿基) 通過(guò)PCR 反應(yīng)非定點(diǎn)地?cái)U(kuò)增片段DNA,然后用凝膠電泳分離擴(kuò)增片段來(lái)進(jìn)行DNA多態(tài)性研究。對(duì)任一特定引物而言,它在基因組DNA序列上有其特定的結(jié)合位點(diǎn),一旦基因組在這些區(qū)域發(fā)生片段DNA插入、缺失或堿基突變,就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點(diǎn)的分布發(fā)生變化,從而導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量和大小發(fā)生改變,表現(xiàn)出多態(tài)性。

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)技術(shù)(AFLP) ,又名限制片段選擇擴(kuò)增技術(shù)(Selective restriction fragment amplifi2cation ,SRFA) ,于1993 年由荷蘭KEYGENE 公司的Zabean 和Vos 等發(fā)明。AFLP 是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一種分子標(biāo)記技術(shù),它將基因組DNA用成對(duì)的限制性內(nèi)切酶雙酶切后產(chǎn)生的片段用接頭(與酶切位點(diǎn)互補(bǔ)) 連接起來(lái),并通過(guò)5′端與接頭互補(bǔ)的半特異性引物擴(kuò)增得到大量片段DNA,從而形成指紋圖譜的分子標(biāo)記技術(shù)。AFLP 指紋呈孟德?tīng)柺焦诧@性和顯隱性遺傳。

SSR 也稱微衛(wèi)星DNA ,是一類由幾個(gè)(多為2～6個(gè)) 堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA 序列,其中zui常見(jiàn)的是雙核苷酸重復(fù),即(CA) n和(TG) n ,每個(gè)微衛(wèi)星DNA 的核心序列結(jié)構(gòu)相同,重復(fù)單位數(shù)目10～60 個(gè),其高度多態(tài)性主要來(lái)源于串聯(lián)數(shù)目的不同。不同遺傳材料重復(fù)次數(shù)不同,導(dǎo)致了SSR 長(zhǎng)度的高度變異性,這一變異性正是SSR 標(biāo)記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。

單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism ,SNP) 被稱為第3 代DNA分子標(biāo)記,是指同一位點(diǎn)的不同等位基因之間個(gè)別核苷酸的差異,這種差異包括單個(gè)堿基的缺失或插入 ,更常見(jiàn)的是單個(gè)核苷酸的替換,且常發(fā)生在嘌呤堿基(A 與G) 和嘧啶堿基(C 與T) 之間。SNP 標(biāo)記可幫助區(qū)分兩個(gè)個(gè)體遺傳物質(zhì)的差異,被認(rèn)為是應(yīng)用前景的遺傳標(biāo)記。