酶是自然界重要的功能蛋白分子，其催化活性在基因編輯及干細胞技術(shù)、靶向藥物的生產(chǎn)、食品工業(yè)、紡織工業(yè)、醫(yī)學(xué)診斷、藥物制備等領(lǐng)域都有著重要的作用。由于溫度、pH、溶劑穩(wěn)定性以及底物特異性和活性的限制，天然酶通常不是工業(yè)生產(chǎn)的較佳選擇，定向進化是改善酶催化活性和熱穩(wěn)定性的常用方法。
基于細胞表達系統(tǒng)的突變體蛋白篩選流程包括構(gòu)建突變基因庫、構(gòu)建載體、轉(zhuǎn)化、挑取單克隆、擴大培養(yǎng)、裂解、純化和活性測試等流程，操作繁瑣、周期長、人力成本高昂。如果目的突變蛋白對宿主細胞有毒害作用，還可能導(dǎo)致表達失敗。突變體蛋白篩選需要更高效的高通量篩選方案。
無細胞蛋白表達（CFPS）是一種沒有活細胞參與的體外蛋白質(zhì)生物合成技術(shù)，在高通量篩選場景具有優(yōu)勢：
①CFPS操作簡單，可搭配高通量移液工作站，實現(xiàn)自動化操作。
②CFPS是開放的反應(yīng)體系，可以根據(jù)特定蛋白質(zhì)的調(diào)整pH、溫度等反應(yīng)條件，且允許在反應(yīng)后上清液中直接檢測突變蛋白功能，無需純化。
③CFPS不受宿主細胞活力的限制，允許生產(chǎn)細胞毒性蛋白質(zhì)。
④CFPS允許使用PCR產(chǎn)物作為模板，極大縮短模板制備流程。
PLD高通量篩選案例
本文展示了珀羅汀生物基于自主研發(fā)的CFPS系統(tǒng)建立的高通量酶篩選方案：
通過簡并引物引入突變，建立突變文庫，利用菌落分離單個突變基因，經(jīng)過菌落PCR獲得線性模板，線性模板直接用于CFPS反應(yīng)，數(shù)小時后獲得突變體酶，直接取上清檢測酶活性。
利用該方案，我們在三天內(nèi)完成了96個phi29 DNA聚合酶突變體的表達，并對其活性進行了檢測，找到了較為高效的phi29 DNA聚合酶突變體。
突變引入及環(huán)化
我們選取了phi29DNA聚合酶的第221位和第350位氨基酸作為突變位點。先利用PCR的方式，將突變通過引物引入片段；再通過重疊PCR的方式整合突變片段。將整合好的目的基因片段和線性化的環(huán)狀片段通過seamless酶進行連接，形成環(huán)化質(zhì)粒。
在此過程中，每次以質(zhì)粒為模板進行PCR之后，使用Dpn I 酶37℃消化1h以去除原始模板。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化并涂板
取5μL引入突變的質(zhì)粒，加入到100μL DH5α感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，置于冰上30min。隨后將上述感受態(tài)細胞置于42°C水浴中，熱激90秒后迅速放回冰浴中，靜置3~5min；再將其加入到500 μL不含抗生素的SOC或LB培養(yǎng)液中，輕輕混勻，37°C震蕩培養(yǎng)1h。通過離心菌液（5000 rpm，1min）沉淀菌體，再將大部分培養(yǎng)液移除，剩余約50~100μL的培養(yǎng)液后重懸菌體，最后，全部均勻涂布到含卡那霉素的LB平板上，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。
挑取單克隆并保菌
向96孔板中加入100μL含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基，然后從LB培養(yǎng)板上挑取單克隆菌落加入96孔板中。再置于37℃的搖床中180rpm震蕩培養(yǎng)1h。
菌體PCR及高通量蛋白表達
從震蕩培養(yǎng)1h的96孔板的每個孔中取出1μL培養(yǎng)基，作為模板加入PCR體系。在經(jīng)過適當(dāng)?shù)腜CR程序后，取5μL PCR反應(yīng)體系，作為模板加入無細胞表達體系。表達4個小時后，即可在體系中產(chǎn)生目的蛋白酶——phi29 DNA 聚合酶。
活性測定
Phi29 DNA聚合酶的活性測定是利用聚合酶活性來擴增綠色熒光蛋白基因的線性模板，通過最終產(chǎn)物綠色熒光的強度對phi29 DNA聚合酶的活性做出判斷。首先從最終的無細胞反應(yīng)體系中直接取出1μL的反應(yīng)上清液作為酶溶液加入到擴增體系，該體系含有使phi29起效的緩沖液、綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒模板以及擴增所需的引物。然后在42℃的條件下擴增2h生成線性模板。最后取5μL的線性模板加入到終體積為50μL的無細胞反應(yīng)體系中，6小時后測定其熒光值，找出活性較強的phi29 DNA聚合酶突變體。
活性結(jié)果
在激發(fā)波長485nm發(fā)射波長535nm的條件下，測定綠色熒光蛋白的熒光值。不同孔中的熒光值有明顯的不同，表明不同phi29 DNA聚合酶的突變體有不同的活性強度。
突變測序
測定活性之后，從之前保存的96孔培養(yǎng)板上取活性強度較高的幾個孔位所對應(yīng)的菌體，擴大培養(yǎng)后進行測序操作。我們成功找到了在此板上活性強度前三位的phi29 DNA聚合酶突變體。其在221位和350位的氨基酸組合如下所示。
總結(jié)
通過上述實驗，我們展示了一種基于珀羅汀無細胞蛋白表達技術(shù)的高通量篩選、驗證突變體酶的方案。該方案在3天內(nèi)完成了近百種突變蛋白的構(gòu)建表達及活性驗證，顯著縮短了蛋白篩選的時間，減少了人工操作成本，可極大提高研發(fā)效率。
除了本文展示的方案，珀羅汀生物還建立了一種通過引物引入突變，并直接通過PCR獲得線性模板的高通量篩選方案，并利用該方案在一天內(nèi)完成了近百種GFP突變體的篩選。具體方案將在后續(xù)文章展示，敬請期待！
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