CCK-8試劑盒是一種基于WST-8的試劑盒，用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速、高靈敏度檢測(cè)等，具有使用方便，檢測(cè)快速，靈敏度高，重復(fù)性?xún)?yōu)于MTT法，毒性小，適合于高通量藥物篩選等大規(guī)模實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)。以下是使用CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)的步驟：
一、細(xì)胞增殖分析
1.培養(yǎng)細(xì)胞并將其接種到96孔板中。
2.在37℃、5% CO2、90%濕度條件下培養(yǎng)24小時(shí)。
3.配制不同濃度梯度的樣本溶液，如300、100、33.3、11.1、3.7、1.2、0.4、0.14uM。
4.每個(gè)濃度三個(gè)復(fù)孔加入到96孔板中，在37℃、5% CO2、90%濕度條件下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間長(zhǎng)度。如6，12，24或48小時(shí)。
5.在CCK-8試劑盒中加入10μL的CCK-8溶液。
6.在37℃、5% CO2、90%濕度條件下培養(yǎng)0.5-4小時(shí)。
7.用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量吸光度。
8.用Excel及Graphpad Prism處理并分析結(jié)果。
二、細(xì)胞毒性分析
1. 制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計(jì)數(shù)
2. 接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)，每孔約100ul細(xì)胞懸液，同樣的樣本可做3個(gè)重復(fù)。
3. 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)2-4小時(shí)，如果不需要貼壁，這步可以省去。
4. 加入不同濃度的毒性物質(zhì)
5. 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：加入毒性物質(zhì)的培養(yǎng)時(shí)間，要看毒性物質(zhì)的性質(zhì)和細(xì)胞的敏感性，一般要根據(jù)細(xì)胞周期來(lái)決定，起碼要一代以上的時(shí)間。
6. 加入10ulCCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來(lái)誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。
7. 培養(yǎng)1-4小時(shí):細(xì)胞種類(lèi)不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話(huà)，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)最佳條件。特別是血液細(xì)胞形成的Formazan很少，需要較長(zhǎng)的顯色時(shí)間（5-6小時(shí)）。
8. 測(cè)定450nm吸光度：建議采用雙波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)450-490nm，參比波長(zhǎng)600-650nm。
本期內(nèi)容：CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)的步驟是怎樣的？
下期內(nèi)容：直擴(kuò)pcr技術(shù)的使用場(chǎng)景及常見(jiàn)問(wèn)題
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