綿羊N-識別蛋白4 (UBR4) ELISA 試劑盒

ELISA試劑盒的那點(diǎn)兒事

酶聯(lián)免疫吸附測定，又稱酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，即ELISA，是酶免疫測定技術(shù)中應(yīng)用的技術(shù)。1971年Engvall等人發(fā)表了使用ELISA定量測定IgG的文章，將1966年用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測定方法。

ELISA的原理

ELISA原理是將抗原或抗體包被在固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合，檢測過程中，通常使用洗板的方式去除非結(jié)合物，最終酶促反應(yīng)后的底物的顏色，對樣本中蛋白進(jìn)行定性與定量。

不按說明書操作會造成的后果

每一個(gè)試劑盒里都會有對應(yīng)的說明書，注意事項(xiàng)里大多都會提到“實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行"。為什么要嚴(yán)格按照說明書操作？為了更完整的回答這個(gè)問題，需要先回顧一下ELISA各種方法的原理。

根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀及檢測的具體條件，可設(shè)計(jì)出不同類型的檢測方法。大致分為以下幾類：

1.雙抗體夾心法測抗原

2.雙抗原夾心法測抗體

3.競爭法測抗原

4.間接法測抗體

總結(jié)如果不按說明書操作可能會出現(xiàn)的不滿意結(jié)果。

A. 先說最嚴(yán)重的操作錯(cuò)誤，看錯(cuò)或壓根不看試劑盒配套說明書，不按操作步驟加樣。比如把競爭法的試劑盒當(dāng)作雙抗體夾心法來做，導(dǎo)致的結(jié)果就是整板顯示很強(qiáng)的藍(lán)色，無任何梯度。

B. 混用別的試劑盒里的試劑。不同廠家或者相同廠家的不同試劑盒，所含的試劑成分很可能是不一樣的，混用導(dǎo)致的結(jié)果是，浪費(fèi)珍貴的樣本，樣品的回收率達(dá)不到預(yù)期值，如果混用不同試劑盒的酶復(fù)合物，會導(dǎo)致顯色過弱或過強(qiáng)，因?yàn)槊糠N試劑盒所用酶復(fù)合物效價(jià)可能不一樣。

C. 不看文獻(xiàn)或者不做預(yù)實(shí)驗(yàn)。比如某個(gè)試劑盒按照其靈敏度范圍和文獻(xiàn)報(bào)道推算樣本應(yīng)該1:10稀釋，結(jié)果稀釋成1:1000，導(dǎo)致的結(jié)果是顯色過弱，結(jié)果不可用。

D. 不校準(zhǔn)移液器及培養(yǎng)箱的溫度濕度。導(dǎo)致工作試劑濃度不準(zhǔn)確，孵育溫度不合適，實(shí)驗(yàn)帶來誤差。

E. 洗滌不充分，每孔洗液加樣過少，或者殘留。導(dǎo)致的結(jié)果是顯色過快，同時(shí)背景較高。

F. 手洗板時(shí)所用槍頭沒有懸空加入洗液，導(dǎo)致洗液污染，整個(gè)實(shí)驗(yàn)失敗。

G. 剩余酶標(biāo)板條未及時(shí)放入干燥袋，導(dǎo)致酶標(biāo)板受潮，下一次再做時(shí)，顯色過弱或污染，CV值過高。

  ELISA常見主要試劑

1. 抗體：單抗特異性強(qiáng)，多抗結(jié)合性高，試劑盒需要高效的配對。

2. 2.抗原：大多為重組蛋白,細(xì)胞因子和待測樣本，高效標(biāo)準(zhǔn)品需NIBSC/WHO校準(zhǔn)。

3. 3.顯色作用體系：首先辣根過氧化物酶（HRP）與常見底物TMB和OPD均可形成顯色體系，再者堿性磷酸酶(AP)的底物為對-硝基苯磷酸酯可形成黃色底物，還有葡萄糖氧化酶（GOD）的葡萄糖氧化酶法形成特殊顯色，最后β-D-半乳糖苷（β-D-Gal）的底物為4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）可生成高強(qiáng)度熒光。

ELISA的類型

根據(jù)試劑的來源和樣本的情況以及檢測的具體條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方法，按照原理及操作，市面的方法有：

  1.間接法ELISA

是檢測抗體的方法，原理為利用酶標(biāo)記的二抗以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，顯色測定。優(yōu)勢在于待測一抗無需標(biāo)記快速便捷。直接法ELISA與間接法ELISA相似，區(qū)別在于一抗酶標(biāo)，檢測孵育也以抗原為主，但直接法ELISA的靈敏度有限，需權(quán)衡使用。

2.夾心法ELISA

又分為雙抗原夾心法和雙抗體夾心法ELISA，原理相似，用于檢測抗體或抗原含量。以雙抗體夾心法為例，捕獲抗體包被在固相載體上，加入抗原或待測樣本結(jié)合，后加入的檢測抗體結(jié)合在抗原上，形成三明治夾心形式。雙抗夾心法是市面最常見與方便分析的方法。

3.競爭法ELISA

小分子抗原與半抗原的檢測方法常用競爭法ELISA，待檢樣本中抗原越多，被結(jié)合的酶標(biāo)抗原的量會減少，彼此形成競爭負(fù)相關(guān)體系，顯色物質(zhì)也就越少，根據(jù)顯色物質(zhì)的比例可擬合得到待測抗原含量。

4.其他方法

a.免疫抑制法測ELISA：固相包被抗原，被檢樣本對底物顯色的抑制程度與樣本中所含抗原的量成正比，二者之差為待測抗原含量，原理類似與競爭法ELISA。

b.阻斷ELISA：目的檢測特異性抗體，也稱為競爭ELISA，原理為固相包被抗原，待測樣本與一抗酶標(biāo)競爭孵育，待檢樣本中抗體越多，顯色越淺，反則反之。非洲豬瘟病毒抗體檢測試劑盒中涉及該法。

c.此外有用于檢測IgM抗體的抗體捕捉ELISA，有固相載體改變的Dot-ELISA（硝酸纖維素膜）和C-ELISA（滌綸布），還有技術(shù)分類的TRFIA和多因子檢測等。

ELISA的評估

ELISA Kit的多指標(biāo)決定了產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣，優(yōu)秀的試劑盒需要對如下6大項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測定評估，分析如下：

  1、準(zhǔn)確性

ELISA Kit的多指標(biāo)決定了產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣，優(yōu)秀的試劑盒需要對如下6大項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測定評估，分析如下：

a.回收率：測定試劑盒對數(shù)據(jù)真實(shí)性的校準(zhǔn)，過高或偏低會產(chǎn)生加樣和假性性的失準(zhǔn)數(shù)據(jù)。

b.線性：測定試劑盒稀釋液與樣本微環(huán)境的的準(zhǔn)確性，過高或偏低均會出現(xiàn)測定的偏差。

  2、精確度

a.板內(nèi)精確度：評價(jià)單次實(shí)驗(yàn)中，同一個(gè)已知濃度不同復(fù)孔的差異。

b.板間精確度：評價(jià)同一樣本，多次實(shí)驗(yàn)的差異。

 3、精密度

檢測限：能顯著區(qū)分空白信號的最小信號值對應(yīng)的濃度，用于評估試劑盒的靈敏度，值越低試劑盒靈敏度越高。

  4、特異性

a.交叉反應(yīng)：評判特異性，不同分子與試劑盒抗體結(jié)合能力，交叉反應(yīng)越大，特異性越差。

b.抗干擾能力：同源物的干擾，內(nèi)源性物質(zhì)對檢測系統(tǒng)的干擾。

  5.天然樣本檢測性

對天然樣本及合適的樣本類型檢測分析。對天然樣本類型確定，避免假陽性或假陰性結(jié)果。

  6、穩(wěn)定性

試劑盒時(shí)效性和穩(wěn)定性是對指標(biāo)檢測的重要保障。穩(wěn)定性越高，試劑盒存儲時(shí)間越久。

ELISA的應(yīng)用

ELISA技術(shù)是特定靶標(biāo)蛋白質(zhì)定量的金標(biāo)準(zhǔn)，提供快速，穩(wěn)定且易于分析的結(jié)果?？梢詫ι锎蠓肿?小分子的定量，對親和力測定評價(jià)或者篩選，還可對重組蛋白或細(xì)胞因子進(jìn)行活性比對分析等運(yùn)用。常應(yīng)用于細(xì)胞因子，趨化因子，生長因子等檢測，同時(shí)應(yīng)用于癌癥、干細(xì)胞、免疫學(xué)、神經(jīng)學(xué)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等研究領(lǐng)域的靶標(biāo)。

ELISA實(shí)驗(yàn)所用試劑-酶的底物與最后步驟詳解介紹！

1，酶的底物

·

HRP的底物

·

HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng)，代表性的過氧化物為H2O2，其反應(yīng)式如下：DH2+ H2O2 D+ H2O

　　上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作比色測定。常用的供氫體有鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。

　OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物的底物。OPD本身難溶于水，OPD·2HCL為水溶性。曾有報(bào)道OPD有致異變性，操作時(shí)應(yīng)予注意。OPD見光易變質(zhì)，與過氧化氫混合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時(shí)用蒸餾水稀釋。先進(jìn)的ELISA試劑盒中則直接配成含保護(hù)劑的工作濃度為0.02% H2O2的應(yīng)用液,只需加入OPD后即可作為底物應(yīng)用液。

　　TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色，目視對比鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無致癌性等優(yōu)點(diǎn)，因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。酶反應(yīng)用HCL或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長為405nm。

ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。

　　另一種HRP的底物為3-(4-羥基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA]，經(jīng)HRP作用后，產(chǎn)物顯熒光，可用熒光光度計(jì)測量。用于ELISA的優(yōu)點(diǎn)為可加寬定量測定的線性范圍。

　　HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)。H2O2應(yīng)用最多，但尿素過氧化物為固體，作為試劑較H2O2方便、穩(wěn)定。試劑盒供應(yīng)尿素過氧化物片劑，用蒸餾水溶解后，在底物緩沖液中密閉、低溫（2～8℃）可穩(wěn)定1年。

綿羊N-識別蛋白4 (UBR4) ELISA 試劑盒

·

AP的底物

·

　　AP為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作為底物，可制成片劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。

2，洗滌液

　　在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。

3，　酶反應(yīng)終止液

　　常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。

4，陽性對照品和陰性對照品

　　陽性對照品(positive control)和陰性對照品(negative control)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對照，因此對照品，特別是陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致。以人血清為標(biāo)本的測定，對照品最好也為人血清，因?yàn)檎Ｈ搜逶诟鞣NELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底。由于大量正常人血甭較難得到，國外試劑盒中的對照品多以復(fù)鈣人血漿(recalcified human plasma)為原料，即在血漿中加入鈣離子，使其中的纖維蛋白質(zhì)凝固，除去凝塊后所得的液體，其組成與血清相似。陰性對照品須先行檢測，確定其中不含待測物質(zhì)。

例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。陽性對照品多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)，其中加入一定量的待檢物質(zhì)，此量最好在試劑說明書中標(biāo)明。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱，在測定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可對標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量有一個(gè)粗略的估計(jì)。國外檢測HBsAg的ELISA試劑盒檢測敏感度約為0.5ng/ml，陽性對照品中含量約為10ng/ml。在對照品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。

5，參考標(biāo)準(zhǔn)品

　　定量測定的ELISA試劑盒（例如甲胎蛋白質(zhì)癌胚抗原測定等）應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測范圍的4-5個(gè)濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中。