豚鼠蛋白聚合蛋白(TPPP) ELISA 試劑盒

本試劑僅供研究使用      

實驗目的：

本試劑盒用于測定人血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中白介素6(IL-6)的含量。

實驗原理：

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人白介素6(IL-6)水平。用純化的白介素6(IL-6)捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入白介素6(IL-6)，再與HRP標記的檢測抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的白介素6(IL-6)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中白介素6(IL-6)含量。

試劑盒組成：

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。

2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。

3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩吮救诨笕匀槐３?/span>2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。

7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

在網上如何才能找到好的ELISA試劑盒?
   現在生物科技日益日新月異的年代，像ELISA試劑盒產品形形色色品牌也許多，隨意在網上搜索下，就會出現許多關于ELISA試劑盒的公司，讓您眼花繚亂，那么怎么才能在網上找到ELISA試劑盒呢？

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操作步驟

1. 標準品的加樣：設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL。

2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3. 加酶：每孔加入酶標試劑100μl，空白孔除外。

4. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。

5. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。

6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

7. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。

8. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

9. 測定：以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

豚鼠蛋白聚合蛋白(TPPP) ELISA 試劑盒

計算：

以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

注意事項：

1. 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。樣本在使用前也要在室溫平衡60分鐘。

2. 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。

3. 各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。

4. 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數（×n×5）。

5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6. 底物請避光保存。

7. 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.

8. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

9. 本試劑不同批號組分不得混用。

ELISA試劑盒運用應當留心哪些事項
1、ELISA試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可運用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2、濃洗刷液可能會有結晶分出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗刷時不影響效果。
3、各步加樣均應運用加樣器，并常常校正其準確性，以避免實驗過失。一次加樣時刻最好控制在5分鐘內，如標本數量多，舉薦運用排槍加樣。
4、請每次測定的一同做規(guī)范曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高(樣本OD值大于規(guī)范品孔孔OD值的)，請先用樣品稀釋液稀釋必定倍數(n倍)后再測定，核算時請最終乘以總稀釋倍數(×n×5)。
5、嚴格按說明書的操作進行，ELISA試劑盒效果判定有必要以酶標儀讀數為準.
6、本試劑不同批號組分不得混用。
7、封板膜只限一次性運用，以避免穿插污染。
8、悉數樣品，洗刷液和各種廢棄物都應按感染物處理。
9、底物請避光保存。

技術提示：

1、混合蛋白溶液時，避免起泡。

2、加校準品與樣本時，每個校準品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應該懸臂加樣，避免交叉污染。

3、合適的溫育時間，和充分的洗滌步驟，是保證實驗結果準確性的必要條件。

4、底物溶液為無色液體，保存過程中變?yōu)樗{色，代表底物溶液已經失效，不得使用。

5、終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后，藍色底物產物，會瞬間變?yōu)辄S色。

6、實驗中，用剩的板條，應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

7、所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴格按照說明書標明的時間、加樣量及加樣順序進行溫育操作。

8、檢測必須符合實驗室管理規(guī)范的規(guī)定，嚴格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應按照傳染物進行處置。

試劑盒性能：

1. 樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.95以上。

2. 批內變異系數與批間變異系數應分別小于10%和15% 。

如何處理ELISA測定抗體疫苗之實驗數據
        在ELISA試劑盒試驗中我們總是碰到許多關于數據處理的難題，為了能我們更多更具體的了解在試驗中數據處理的問題，下面一起來看看ELISA測定抗體之怎么處理試驗數據。
        ELISA做得很好的話批間CV都要有10～15％左右，用同一個抗原，但對于包被的抗原濃度對OD的影響不是很大，只要不是不同太大即可?？寡瀹斎灰猛粋€稀釋度了。別的比較的話就必每批，每塊板上的樣品都要伴隨著一個參比品一同做，參比品仍是同一個這樣才干確保試驗成果的可比性。
剖析：
（1）將同一只動物免疫不同時刻后抗體產生的效價進行比較。
（2）由上面能夠得出一組數據，舉個比如即如某個免疫間期抗體升高2倍的有多少，升高4，8，16...的各有多少，然后可知大多數情況下可升高多少，即此種升高率的陽性率，然后再用泊松散布證明此陽性率是否贊同整體在這個免疫間期增高的陽性率，仍是由于隨機誤差的原因使試驗得到了這個成果。
（3）計算出不同間期的效價水平后，能夠用方差剖析進行整體比較，證明不同間期免疫的作用差異是否有計算學含義；然后再兩兩之間進行比較，看免疫作用*顯著的是哪個間期。

保存條件及有效期：

1. 試劑盒保存： 2-8℃。

2．有效期： 6個月