豚鼠膜聯(lián)蛋白A2(ANXA2 ) ELISA 試劑盒   

本試劑僅供研究使用       

實驗目的：

本試劑盒用于測定人血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中白介素6(IL-6)的含量。

實驗原理：

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人白介素6(IL-6)水平。用純化的白介素6(IL-6)捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入白介素6(IL-6)，再與HRP標記的檢測抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的白介素6(IL-6)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中白介素6(IL-6)含量。

試劑盒組成：

應用

用于阻斷能受體對人內(nèi)皮細胞體外血管生成的影響研究

普萘洛爾、酚妥拉明抑制人微血管內(nèi)皮細胞體外血管生成目的研究離體情況下,p-AR阻斷劑普萘洛爾、a-AR阻斷劑酚妥拉明對人微血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移、成管及VEGF、VEGFR-2、Ang1、Ang2、Tie-2表達的影響。

方法1.細胞免疫熒光鑒定內(nèi)皮細胞：細胞采用免疫熒光染色Ⅷ因子進行鑒定。將人皮膚微血管內(nèi)皮細胞和人腦微血管內(nèi)皮細胞接種于24孔板爬片。待細胞融合至80%-90%時,4%冰固定20分鐘,0.2%Triton X-100通透10分鐘,羊血清封閉30分鐘。兔多克隆Ⅷ因子（vWF）一抗4℃濕盒內(nèi)過夜。TRITC標記的羊抗兔二抗室溫孵育2小時（避光）。Hochest（1μg/ml）染核15分鐘（避光）后10%甘油封片。正置熒光顯微鏡下觀察、拍片（×200倍）。

2. Western blot檢測人微血管內(nèi)皮細胞a-AR的表達：未經(jīng)藥物處理的人皮膚微血管內(nèi)皮細胞和人腦微血管內(nèi)皮細胞經(jīng)裂解獲得總蛋白。BCA定量,沸水滅活。取總蛋白約40μg進行SDS-PAGE凝膠電泳后,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%BSA封閉1小時,蛋白樣品分別在4℃冰箱孵育兔多克隆抗α1-AR、α2-AR一抗過夜。次日在37℃孵箱中孵育相應的二抗1h。采用超敏ECL化學發(fā)光試劑盒顯色,于暗室內(nèi)壓片,顯影定影。

3.細胞增殖實驗：將人皮膚微血管內(nèi)皮細胞種植于96孔板,將不同濃度梯度的普萘洛爾（0,25,50,75,100μM）、酚妥拉明（0,10,30,50,70μg/ml）分別處理細胞48h。然后每孔加入10μlCCK-8,孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h。之后于酶標儀測450nm下吸光度值。

怎么挑選適合自己實驗的抗體

一、關于特異性的挑選：

      特異性的挑選首要需求考慮四個方面：蛋白特異性、種屬特異性、試驗方法特異性、符號物的特異性。

1、蛋白特異性：

      針對需求檢測的蛋白查找抗體，幾個細節(jié)要區(qū)分，重組表達的蛋白和內(nèi)源性蛋白的檢測，對抗體的要求是不一樣的，注意檢查抗體說明書的檢測說明。假如重組蛋白不是全長表達，則需求注意抗體的免疫原區(qū)域是否在重組蛋白區(qū)域內(nèi)。

內(nèi)源性蛋白能清楚其剪切與潤飾的方式，特殊表型的蛋白需求進行序列比對，并結(jié)合抗體免疫原序列，檢查穿插反應的狀況。磷酸化蛋白檢測需求確認具體位點，不同位點的磷酸化意味著或許有不同的機制存在，不宜混為一談。

2、種屬特異性：

      同種蛋白不同物種，有著或大或小的差異。目前大部分商品化抗體都是以人源蛋白序列為模板重組蛋白或規(guī)劃多肽抗原的，根據(jù)蛋白的同源性狀況與其他種屬發(fā)生穿插反應。需求參照說明書注明的可反應種屬信息。

一些稀有種屬很難找到抗體，可以經(jīng)過蛋白的序列比對，挑選同源序列免疫的抗體，不過一般這種狀況生產(chǎn)商不會受理其關于質(zhì)量的申述，假如可以申請到免費的抗體樣品，則利于抗體挑選。。

3、符號物的特異性

      一般基于試驗操作的試驗方法不會運用帶有符號的一抗，比方WB、IHC等，都是經(jīng)過二抗類的試劑符號達到成果出現(xiàn)的意圖?？墒腔趦x器剖析的一些試驗，或許就會運用到直接符號的一抗，比方流式試驗。那么需求了解到自己將要運用的儀器能檢測到的熒光規(guī)模，針對不通的參數(shù)要求挑選對應的符號物。在免疫熒光雙標試驗中，需求選配不同的熒光符號物。

二、抗體種屬來歷的挑選：

      有人以為單抗比多抗好，其實這并不是一個嚴謹?shù)挠^點，只能說在或許性上單抗的特異性更好一些，而多抗的親和力會優(yōu)于單抗，而且特異性并不一定就遜于單抗，首要看抗原的規(guī)劃水平。

      目前商品化抗體里單抗首要是鼠單抗、兔單抗，多抗首要是兔多抗、山羊多抗等，其他種屬來歷抗體較少。不主張糾結(jié)于單抗好還是多抗好，能做出試驗的抗體便是好抗體。

      在挑選上一般主張試驗種屬和抗體種屬親緣性越遠越好，不宜同源?？贵w不同種屬會要影響接下來二抗的選配。特別是在免疫熒光雙標試驗中，需求在差異于試驗種屬的基礎上，區(qū)分開兩個目標的抗體種屬來歷，以便于二抗差異識別。

三、關于品牌的挑選：

      由于抗體品質(zhì)的異質(zhì)化，關于抗體的品牌挑選就被我們所注重，可是不管是什么品牌都難免會遇到不合適自己試驗的抗體。所以一般主張考慮那些業(yè)界普遍認可、購買方便、專業(yè)、售后處理快捷的品牌。

      一些乃至都沒有正式代理的，只能備選。一起購買時一定要找可以供給產(chǎn)品指導、試驗剖析、售后處理的正規(guī)代理商購買，防止由于買到假貨水貨影響試驗。

其實或許只是生產(chǎn)商只檢測時運用了不同的種屬不同的樣品類型，或是參照了不同的文獻，對運用者來說，相同的樣品，不管運用哪個品牌的，只需抗體是對的，意圖條帶只會出現(xiàn)在相同的位置。

豚鼠膜聯(lián)蛋白A2(ANXA2 ) ELISA 試劑盒    

計算：

以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

注意事項：

1. 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。樣本在使用前也要在室溫平衡60分鐘。

2. 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。

3. 各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4. 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6. 底物請避光保存。

7. 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

8. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

9. 本試劑不同批號組分不得混用。

ELISA試劑盒運用應當留心哪些事項
1、ELISA試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可運用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2、濃洗刷液可能會有結(jié)晶分出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗刷時不影響效果。
3、各步加樣均應運用加樣器，并常常校正其準確性，以避免實驗過失。一次加樣時刻最好控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，舉薦運用排槍加樣。
4、請每次測定的一同做規(guī)范曲線，最好做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高(樣本OD值大于規(guī)范品孔孔OD值的)，請先用樣品稀釋液稀釋必定倍數(shù)(n倍)后再測定，核算時請最終乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。
5、嚴格按說明書的操作進行，ELISA試劑盒效果判定有必要以酶標儀讀數(shù)為準.
6、本試劑不同批號組分不得混用。
7、封板膜只限一次性運用，以避免穿插污染。
8、悉數(shù)樣品，洗刷液和各種廢棄物都應按感染物處理。
9、底物請避光保存。

技術提示：

1、混合蛋白溶液時，避免起泡。

2、加校準品與樣本時，每個校準品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應該懸臂加樣，避免交叉污染。

3、合適的溫育時間，和充分的洗滌步驟，是保證實驗結(jié)果準確性的必要條件。

4、底物溶液為無色液體，保存過程中變?yōu)樗{色，代表底物溶液已經(jīng)失效，不得使用。

5、終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后，藍色底物產(chǎn)物，會瞬間變?yōu)辄S色。

6、實驗中，用剩的板條，應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

7、所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴格按照說明書標明的時間、加樣量及加樣順序進行溫育操作。

8、檢測必須符合實驗室管理規(guī)范的規(guī)定，嚴格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應按照傳染物進行處置。

試劑盒性能：

1. 樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值為0.95以上。

2. 批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應分別小于10%和15% 。

抗體的保質(zhì)期與儲存溫度相關嗎
作為各類種屬的高質(zhì)量血清供應商，一般客戶咨詢血清購買時，我們都會推薦牛血清。而我公司zui為熱銷的血清產(chǎn)品中莫過于胎牛血清了，那么為何牛血清在細胞培養(yǎng)實驗中如此受寵呢？據(jù)酶聯(lián)生物技術員分析，主要原因有這五個方面：
1. 提供結(jié)合蛋白：作用是攜帶重要地低分子量物質(zhì)，在細胞代謝過程中起重要作用。
2. 提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷。
3. 提供基本營養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、維生等是細胞生長必須的物質(zhì)。
4. 提供激素和各種生長因子。
5. 對培養(yǎng)中的細胞起到某些保護作用。
針對第五個原因，我們來重點談談。有一些細胞，如內(nèi)皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)在則有目的的使用血清來終止的消化作用。
我司技術員分析，這是因為已經(jīng)被廣泛用于貼壁細胞的消化傳代。血清蛋白形成了的粘度可以保護細胞免受機械損傷，特別是在懸浮培養(yǎng)攪拌時，粘度起到重要作用。還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用。
特別說明到了有多位老師提出問題：人血清一定要加熱滅活嗎？不然會怎樣？其實對于它的加熱滅活是應該根據(jù)情況而定的。
很多朋友在使用實驗者認為一定需要加熱滅活，其實這個認知是不正確的，是否需要滅活是要根據(jù)情況而定。人們通常通過在56℃加熱30分鐘的辦法，來滅活其中的補體，以及其中可能的微生物（比如支原體）的污染。
加熱滅活帶來的問題是，其中的氨基酸、維生素和生長因子等也會不同程度的被破壞。
但是它的補體含量很低，即使在未稀釋的胎牛血清中，也觀察不到溶血現(xiàn)象。另外37℃的加熱能夠有效滅活補體。所以對它而言，并不需要通過專門的熱滅活來滅活其中的補體。
早期的人血清制備中的濾膜的孔徑大于0.22um，不能有效的去除支原體的污染。熱滅活可以去除支原體的污染。但是現(xiàn)在制備中的終端濾膜的孔徑為0.1um甚至小到0.04um，所以一般沒有支原體的污染。
通過以上，我們公司總結(jié)：除非有特別的情況，標準廠家生產(chǎn)的一般不需要加熱滅活。不過因考慮到其質(zhì)量問題，為安全起見，還是以加熱滅活為好。