犬白介素2(IL-2)ELISA試劑盒

競爭ELISA
此法主要用于測定小分子抗原及半抗原,其原理類似于放射免疫測定。其基本程序為:
① 抗體包被 → 4℃過夜,洗滌三次、拋干
② 加入待檢抗原及一定量的酶標抗原(對照孔僅加酶標抗原)→ 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
③ 加底物液 → 37℃ 20分鐘,加終止液
④ 用ELISA檢測儀測定OD值。
被結(jié)合的酶標抗原的量由酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物的量來確定,如果待檢溶液中抗原越多,被結(jié)合的標記抗原的量就越少,有色產(chǎn)物就減少,這樣根據(jù)有色產(chǎn)物的變化就可求出未知抗原的量。此法的優(yōu)點在于快速、特異性高、且可用于小分子抗原及半抗原的檢測;其主要不足在于每種抗原都要進行酶標記,而且因為抗原的結(jié)構(gòu)不同,還需應(yīng)用不同的結(jié)合方法。此外,試驗中應(yīng)用酶標抗原的量較多。
阻斷ELISA
本法主要用于檢測型特異性抗體。該方法現(xiàn)已成為豬TGE)、豬偽(PR)及豬胸膜(AP)的主要檢測方法。下面以AP2型抗體的阻斷ELISA檢測法為例介紹其操作程序:
① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃過夜,洗滌三次、拋干
② 用200μl阻斷緩沖液進行封閉 → 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
③ 加工作量1:4稀釋被檢豬血清100μl → 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
④ 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分鐘,洗滌三次、拋干
⑤ 加100μl工作量豬抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分鐘,加終止液
⑦ 用ELISA檢測儀測定OD值。
本試驗同時設(shè)標準陰、陽性血清對照、兔抗AP2型陽性對照、空白對照。
抗體捕捉ELISA
本法主要用于檢測IgM抗體。由于IgM抗體出現(xiàn)于感染早期,所以檢測出IgM,則可作為某種疾病的早期診斷?？贵w捕捉ELISA根據(jù)所用標記方式不同可分為標記抗原、標記抗體、標記抗抗體捕捉ELISA等幾種,其中以標記抗原捕捉ELISA比較有代表性,該方法的主要程序為:
① 用抗u鏈(抗IgM重鏈)抗體包被→37℃ 60分鐘后置4℃過夜,洗滌三次、拋干
② 加待檢血清 → 37℃ 2小時,洗滌三次、拋干
③ 加酶標抗原 → 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
④ 加底物液 → 37℃ 20分鐘,加終止液
⑤ 用ELISA檢測儀測定OD值。
斑點ELISA
與常規(guī)的微量板ELISA比較,Dot-ELISA具有簡便、節(jié)省抗原等優(yōu)點,而且結(jié)果可長期保存;但其也有不足,主要是在結(jié)果判定上比較主觀,特異性不夠高等。該方法的主要操作程序為:
⑴載體膜的預(yù)處理及抗原包被?取硝酸纖維素膜用蒸餾水浸泡后,稍加干燥進行壓圈。將陰性、陽性抗原及被檢測抗原適度稀釋后加入圈中,置37℃使硝酸纖維素膜 干燥。每張7cm×2.3cm的膜一般可點加40-53個樣品,每個壓圈可加抗原液1-20μl。
⑵ 封閉?將硝酸纖維素膜置于封閉液中,37℃感作15-30分鐘。封閉液多采用含有正常動物血清、pH7.2或pH7.4的PBS。
⑶ 加被檢血清?可直接在抗原圈上加,也可剪下抗原圈、置于微量板孔中,再加入一定量適度稀釋的待檢血清,37℃反應(yīng)一定時間,用洗滌液洗三次,每次1-3分鐘。洗滌液一般為一定濃度的PBS-Tween溶液。
⑷ 加酶標抗體,37℃反應(yīng)一定時間后,用洗滌液洗三次。
⑸顯色?加入新鮮配制的底物液,37℃反應(yīng)一定時間后,去掉底物液,加蒸餾水洗滌終止反應(yīng)。
⑹ 結(jié)果判定?以陽性、陰險血清作為對照,膜片中央出現(xiàn)深棕紅色斑點者為陽性反應(yīng),否則為陰性反應(yīng)。

首先將特異性抗體包被于固相載體表面,經(jīng)洗滌后分成兩組:一組加酶標記抗原和被測抗原的混合液,另一組只加酶標記抗原,經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色,這兩組底物降解量之差,即為所要測定的未知抗原的量。此方法測定的抗原只要有一個結(jié)合部位即可,對小分子抗原如激素和藥物類的測定常用此法。優(yōu)點是快,缺點是需要較多量的酶標記抗原。

ELISA的樣本實驗準備

在收集樣本前都必須有一個完整的計劃,必須清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定。對收集后當天就進行檢測的樣本,及時儲存在4℃?zhèn)溆?。對于隔天再檢測的樣本,及時分裝后凍存在-20℃?zhèn)溆?有條件的, -71℃凍存?zhèn)溆?。標?/span>
2. 血漿:
應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。
3. 尿液:
用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實行。
4. 細胞培養(yǎng)上清:
檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。
5. 培養(yǎng)細胞
檢測細胞內(nèi)的成份時,用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融或加入組織蛋白萃取試劑,以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。
6. 組織標本
切割標本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4),或組織蛋白萃取試劑, 用手工或勻漿器將標本勻漿化。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。

90分鐘一步法ELISA試劑盒:
1.高效,靈敏,特異的抗體
2.穩(wěn)定的重復(fù)性和可靠性
3.吸附性能好,空白值低,孔底透明度高和固相載體
4.適用血清,血漿,組織勻漿液,細胞培養(yǎng)上清液,尿液等多種標本型

犬白介素2(IL-2)ELISA試劑盒

操作步驟
實驗開始前,請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?試劑或樣品稀釋時,均需混勻,混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標準曲線。如樣品濃度過高時,用樣品稀釋液進行稀釋,以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1.加樣:分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl,余孔分別加標準品或待測樣品100μl,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,酶標板加上蓋或覆膜,37℃反應(yīng)120分鐘。
為保證實驗結(jié)果有效性,每次實驗請使用新的標準品溶液。
2.棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔標記抗體工作液 100μl(取1μl抗體加99μl標記抗體稀釋液的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內(nèi)配制),37℃,60分鐘。
3.溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分鐘,350μl/每孔,甩干。
4.每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液(同標記抗體工作液) 100μl,37℃,60分鐘。
5.溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,350μl/每孔,甩干。
6.依序每孔加底物溶液90μl,37℃避光顯色(30分鐘內(nèi),此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色,后3-4孔梯度不明顯,即可終止)。
7.依序每孔加終止溶液50μl,終止反應(yīng)(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性,底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。
注:
1. 用戶在初次使用試劑盒時,應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘,以便試劑集中到管底。
2. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔,該孔不加任何試劑,只是 加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。
3. 為防止樣品蒸發(fā),試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),酶標板加上蓋或覆膜。
4. 未使用完的酶標板或者試劑,請于2-8℃保存。標準品、標記抗體工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標準品、標記抗體工作液或、辣根過氧化物酶標記親和素工作液。
5. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,以保證檢測結(jié)果的準確性。
洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體;在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要,重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板:如果有自動洗板機,應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
計算
以標準物的濃度為橫坐標(對數(shù)坐標),OD值為縱坐標(普通坐標),在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際濃度。