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應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,食品,電子 |
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熒光和熒光壽命
分子包含多個單能態(tài)S0、S1、S2…和三重態(tài)T1…,每個能態(tài)都包含多個精細的能級。正常情況下,大部分電子處在*低能態(tài)即基態(tài)S0 的*低能級上,當分子被光束照射,會吸收光子能量,電子被激發(fā)到更高的能態(tài)S1 或S2 上,在S2 能態(tài)上的電子只能存在很短暫的時間,便會通過內(nèi)轉(zhuǎn)換過程躍遷到S1 上,而S1 能態(tài)上的電子亦會在極短時間內(nèi)躍遷到S1 的*低能級上,而這些電子會存在一段時間后通過震蕩弛豫輻射躍遷到基態(tài),這個過程會釋放一個光子,即熒光。
此外,亦會有電子躍遷至三重態(tài)T1 上,再由T1 躍遷至基態(tài),我們稱之為磷光。
熒光特性
研究熒光特性時,主要在以下幾方面進行分析:激發(fā)光譜,發(fā)射光譜、熒光強度、偏振熒光、熒光發(fā)光量子產(chǎn)率、熒光壽命等。其中熒光壽命(Fluorescence Lifetime)是指熒光分子在激發(fā)態(tài)上存在的平均時間(納秒量級)。
熒光壽命測試
熒光壽命一般在幾納秒至幾百納秒之間,如今主要有兩類測試方法:時域測量和頻域測量時間穩(wěn)定性實驗測試曲線:
1 時域測量
由一束窄脈沖將熒光分子激發(fā)至較高能態(tài)S1,接著測量熒光的發(fā)射幾率隨時間的變化。其中目前廣泛應(yīng)用的是時間相關(guān)單光子計數(shù),即TCSPC(Time Correlated Single Photon Counting)
時間相關(guān)單光子計數(shù)(TCSPC) 實現(xiàn)了從百ps-ns-us 的瞬態(tài)測試,此方法對數(shù)據(jù)的獲取*依賴快速探測器和高速電路。用統(tǒng)計的方法計算樣品受激后發(fā)出的第一個( 也是*一的一個) 光子與激發(fā)光之間的時間差,也就是下圖的START( 激發(fā)時刻) 與STOP( 發(fā)光時刻) 的時間差。由于對于Stop 信號的要求,所以TCSPC 一般需要高重復(fù)頻率的光源作為激發(fā)源,其重復(fù)至少要在100KHz 以上,多數(shù)的光源都會達到MHz 量級;同時,在一般情況下還要對Stop 信號做數(shù)量上的控制,做到盡量滿足在一個激發(fā)周期內(nèi),樣品產(chǎn)生且只產(chǎn)生一個光子的有效熒光信號,避免光子對的出現(xiàn)。
2 頻域測量
對連續(xù)激發(fā)光進行振幅調(diào)制后,分子發(fā)出的熒光強度也會受到振幅調(diào)制,兩個調(diào)制信號之間存在與熒光壽命相關(guān)的相位差,因此可以測量該相位差計算熒光壽命。
左圖為正弦調(diào)制激發(fā)光(綠色)頻域顯示,發(fā)射光信號(紅色)相應(yīng)的相位變化頻域顯示。
右圖為對應(yīng)不同壽命的調(diào)制和相位的頻域顯示。TM- 調(diào)制壽命,TP- 相位壽命。[1]
顯微熒光壽命成像技術(shù)(FLIM)
顯微熒光壽命成像技術(shù)(Fluorescence Lifetime ImagingMicroscopy,F(xiàn)LIM)是一種在顯微尺度下展現(xiàn)熒光壽命空間分布的技術(shù),由于其不受樣品濃度影響,具有其他熒光成像技術(shù)無法代替的優(yōu)異性能,目前在生物醫(yī)學(xué)工程、光電半導(dǎo)體材料等領(lǐng)域是一種重要的表征測量手段。
FLIM 一般分為寬場FLIM 和激光掃描FLIM。
寬場FLIM(Wide Field FLIM,WFM)
該技術(shù)是用平行光照明并由物鏡聚焦樣品獲得熒光信號,再由一寬場相機采集熒光成像。寬場FLIM 常用于快速獲取大面積樣品成像。時域或是頻域壽命采集都可以應(yīng)用在寬場成像FLIM 上。寬場FLIM 有更高幀率和低損傷的優(yōu)勢。
2 激光掃描FLIM(Laser Scanning FLIM,LSM)
激光掃描FLIM 是針對選定區(qū)域內(nèi)的樣品逐點獲取其熒光衰減曲線,再經(jīng)過擬合最終合成熒光壽命圖像。相比寬場FLIM,其在空間分辨率、信噪比方面有更大的優(yōu)勢。掃描方式有兩種:一種是固定樣品,移動激光進行掃描,一種是固定激光,電動位移臺帶動樣品移動進行掃描。
超快熒光測試系統(tǒng)FLIM應(yīng)用
材料科學(xué)領(lǐng)域寬禁帶半導(dǎo)體如GaN、SiC 等體系的少子壽命mapping 測量
量子點如CdSe@ZnS 等用作熒光壽命成像顯微鏡探針
鈣鈦礦電池/LED 薄膜的組分分析、缺陷檢測
銅銦鎵硒CIGS,銅鋅錫硫CZTS 薄膜太陽能電池的組分、缺陷檢測
鑭系上轉(zhuǎn)換納米顆粒
GaAs 或GaAsP 量子阱的載流子擴散研究
生命科學(xué)領(lǐng)域
細胞體自身熒光壽命分析
自身熒光相對熒光標記的有效區(qū)分
活細胞內(nèi)水介質(zhì)的PH 值測量
局部氧氣濃度測量
具有相同頻譜性質(zhì)的不同熒光標記的區(qū)分
活細胞內(nèi)鈣濃度測量
時間分辨共振能量轉(zhuǎn)移(FRET):納米級尺度上的遠差測量,環(huán)境敏感的FRET 探針定量測量
代謝成像:NAD(P)H 和FAD 胞質(zhì)體的熒光壽命成像
超快熒光測試系統(tǒng)FLIM應(yīng)用案例
1 用熒光分子對海拉細胞進行染色
用熒光分子轉(zhuǎn)子Bodipy-C12 對海拉細胞(宮頸癌細胞的一種) 進行染色。
(a) 顯微熒光壽命成像圖,壽命范圍1ns(藍色)到2.5ns(紅色);
(b) 熒光壽命直方圖,脂肪滴的短壽命約在1.6ns 附近,細胞中其他位置壽命較長,在1.8ns 附近。
用熒光分子轉(zhuǎn)子的時間分辨測量*大的好處在于熒光壽命具備足夠清晰的標簽特性,且與熒光團的濃度無關(guān)。[2]
2 金屬修飾熒光
金屬修飾熒光:
(a) 熒光壽命是熒光團到金表面距離的函數(shù);
(b) 用綠色熒光蛋白(GFP)標記乳腺腺癌細胞的細胞膜的共聚焦xz 橫截面,垂直比例尺:5m;
(c) b 圖的FLIM 圖,金表面附近的GFP 熒光壽命縮短。[2]
3 鈣鈦礦太陽能電池
下圖研究中,展示了一種動態(tài)熱風(fēng)(DHA)制備工藝來控制全無機PSC 的薄膜形態(tài)和穩(wěn)定性,該工藝不含有常規(guī)的有害反溶劑,可以在大氣環(huán)境中制備。同時,鈣鈦礦摻有鋇(Ba2+) 堿金屬離子(BaI2:CsPbI2Br)。這種DHA 方法有助于形成均勻的晶粒并控制結(jié)晶,從而形成穩(wěn)定的全無機PSC。從而在環(huán)境條件下形成完整的黑色相。經(jīng)過DHA處理的鈣鈦礦光伏器件,在0.09cm小面積下,效率為14.85%,在1x1cm的大面積下,具有13.78%的*高效率。DHA方法制備的器件在300h后仍然保持初始效率的92%。
4 MQWs 多量子阱研究
在(a) 藍寶石和(b) GaN 上生長的MQWs 的共焦PL mapping 圖像。具有較小尺寸的發(fā)光團的最高密度是觀察到在GaN 上生長的MQWs。在(c) 藍寶石和(d)GaN 上生長的MQWs 的共焦TRPL mapping 圖。僅對于在GaN 上生長的MQWs,強的PL 強度區(qū)域與較長PL 衰減時間的區(qū)域很好地匹配。在(e) 藍寶石和(f)GaN 上生長的MQWs 在A 點和B 點測量的局部PL 衰減曲線,均標記在圖中。對于在GaN 上生長的MQWs,點A 和B 之間的PL 衰減時間差更高。
參數(shù)配置
北京卓立漢光儀器有限公司提供的顯微熒光壽命成像系統(tǒng)是基于顯微和時間相關(guān)單光子計數(shù)技術(shù),配合高精度位移臺得到微觀樣品表面各空間分布點的熒光衰減曲線,再經(jīng)過用數(shù)據(jù)擬合,得到樣品表面發(fā)光壽命表征的影像。是光電半導(dǎo)體材料、熒光標記常用熒光分子等類似熒光壽命大多分布在納秒、幾十、幾百納秒尺度的物質(zhì)的選擇。
參數(shù)指標:
系統(tǒng)性能指標 | |
光譜掃描范圍 | 200-900nm |
最小時間分辨率 | 16ps |
熒光壽命測量范圍 | 500ps-1μs@ 皮秒脈沖激光器 |
空間分辨率 | ≤1μm@100X 物鏡@405nm 皮秒脈沖激光器 |
熒光壽命檢測IRF | ≤2ns |
配置參數(shù) | |
激發(fā)源及匹配光譜范圍 (光源參數(shù)基于 50MHz 重復(fù)頻率) | 375nm 皮秒脈沖激光器,脈寬:30ps,平均功率1.5mW,熒光波段:400-850nm |
405nm 皮秒脈沖激光器,脈寬:25ps,平均功率2.5mW,熒光波段:430-920nm | |
450nm 皮秒脈沖激光器,脈寬:50ps,平均功率1.9mW,熒光波段:485-950nm | |
488nm 皮秒脈沖激光器,脈寬:70ps,平均功率1.3mW,熒光波段:500-950nm | |
510nm 皮秒脈沖激光器,脈寬:75ps,平均功率1.1mW,熒光波段:535-950nm | |
635nm 皮秒脈沖激光器,脈寬:65ps,平均功率4.3mW,熒光波段:670-950nm | |
660nm 皮秒脈沖激光器,脈寬:60ps,平均功率1.9mW,熒光波段:690-950nm | |
670nm 皮秒脈沖激光器,脈寬:40ps,平均功率0.8mW,熒光波段:700-950nm | |
科研級正置顯微鏡 | 落射明暗場鹵素?zé)粽彰鳎?2V,100W 5 孔物鏡轉(zhuǎn)盤,標配明場用物鏡:10×,50×,100× 監(jiān)視CCD:高清彩色CMOS 攝像頭,像元尺寸:3.6μm*3.6μm, 有效像素:1280H*1024V,掃描方式:逐行,快門方式:電子快門 |
電動位移臺 | 高精度電動XY 樣品臺,行程:75*50mm(120*80mm 可選), 最小步進:50nm,重復(fù)定位精度:< 1μm |
光譜儀 | 320mm 焦距影像校正單色儀,雙入口、狹縫出口、CCD 出口, 配置三塊68×68mm 大面積光柵,波長準確度:±0.1nm, 波長重復(fù)性:±0.01nm,掃描步距:0.0025nm,焦面尺寸:30mm(w)×14mm(h), 狹縫縫寬:0.01-3mm 連續(xù)電動可調(diào) |
探測器:制冷型紫外可見光電倍增管,光譜范圍:185-900nm(標配,可擴展) | |
光譜CCD (可擴展PLmapping) | 低噪音科學(xué)級光譜CCD(LDC-DD),芯片格式:2000x256, 像元尺寸:15μm*15μ m, 探測面:30mm*3.8mm,背照式深耗盡芯片, 低暗電流,*低制冷溫度-60℃ @25℃環(huán)境溫度,風(fēng)冷,最高量子效率值>95% |
時間相關(guān)單光子計數(shù)器(TCSPC) | 時間分辨率:16/32/64/128/256/512/1024ps……33.55μs,死時間< 10ns, *高65535 個直方圖時間窗口,瞬時飽和計數(shù)率:100Mcps,支持穩(wěn)態(tài)光譜測試; |
OmniFluo-FM 熒光壽命成像專用軟件 | 控制功能:控制樣品平移臺移動,通過顯微鏡的明場光學(xué)像定位到合適區(qū)域, 框選掃描區(qū)域進行掃描,逐點獲得熒光衰減曲線,實時生成熒光圖像等 數(shù)據(jù)處理功能:自動對掃描獲得的FLIM 數(shù)據(jù),逐點進行多組分熒光壽命擬合 (組分數(shù)小于等于4),對逐點擬合獲得的熒光強度、熒光壽命等信息生成 偽彩色圖像顯示 圖像處理功能:直方圖、色表、等高線、截線分析、3D 顯示等 |
操作電腦 | 品牌操作電腦,Windows 10 操作系統(tǒng) |
軟件界面
控制測試界面
測試軟件的界面遵循“All In One"的簡潔設(shè)計思路,用戶可在下圖所示的控制界面中完成采集數(shù)據(jù)的所有步驟:包括控制樣品平移臺移動,通過顯微鏡的明場光學(xué)像定位到合適區(qū)域,框選掃描區(qū)域進行掃描,逐點獲得熒光衰減曲線,實時生成熒光圖像等。
數(shù)據(jù)處理界面
功能豐富的熒光壽命數(shù)據(jù)處理軟件,充分挖掘用戶數(shù)據(jù)中的寶貴信息??勺詣訉呙璜@得的FLIM 數(shù)據(jù),逐點進行多組分熒光壽命擬合(組分數(shù)小于等于4),對逐點擬合獲得的熒光強度、熒光壽命等信息生成偽彩色圖像顯示。
自主開發(fā)的一套時間相關(guān)單光子計數(shù)(TCSPC)熒光壽命的擬合算法,可對熒光衰減曲線中最多包含4 個時間組分的熒光過程進行擬合,獲得每個組分的熒光壽命,光子數(shù)比例,計算評價函數(shù)和殘差。TCSPC 熒光壽命通常并非簡單的指數(shù)衰減過程,而是與光源及探測器相關(guān)的儀器響應(yīng)函數(shù)(IRF)與熒光衰減過程相互卷積的結(jié)果,因此適當?shù)臄M合方法和參數(shù)選擇對獲得正確可靠的熒光壽命非常重要。該軟件可導(dǎo)入實際測量的IRF 對衰減曲線進行卷積計算和擬合。但是大多數(shù)情況下, IRF 很難正確的從實驗獲得,針對這種情況,軟件提供了兩種無需實驗獲取IRF 的擬合方法:
1.通過算法對數(shù)據(jù)上升沿進行擬合,獲得時間響應(yīng)函數(shù)IRF,然后對整條衰減曲線進行卷積計算和擬合得到熒光壽命。
2.對于衰減時間遠長于儀器響應(yīng)時間的,可對衰減曲線下降沿進行直接的指數(shù)擬合。該軟件經(jīng)過大量測試,可以很好的滿足各種場合的用戶需求。
MicroLED 微盤的熒光強度像(3D 顯示):
測試案例