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1. 前言

復(fù)方duo粘菌素B軟膏為硫酸duo粘菌素B、硫酸新霉素、桿菌肽和鹽酸li多卡因組成的復(fù)方制劑，用于預(yù)防皮膚割傷、擦傷、燒燙傷、手術(shù)傷口等皮膚創(chuàng)面的細(xì)菌感染及暫時(shí)緩解疼痛等不適癥狀。硫酸duo粘菌素B為多肽類抗生素，通過干擾細(xì)菌膜通透性與核糖體功能而導(dǎo)致細(xì)菌死亡，對(duì)銅綠假單胞菌、大腸桿菌、嗜血桿菌等有良好的抗菌作用。硫酸新霉素為氨基糖苷類抗生素，可阻礙細(xì)菌核糖體30S亞基相聯(lián)結(jié)的蛋白質(zhì)合成，引起其遺傳密碼錯(cuò)讀而導(dǎo)致細(xì)菌死亡，抗菌譜較廣。桿菌肽為多肽類抗生素，通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁粘肽的合成而導(dǎo)致細(xì)菌死亡，主要對(duì)革蘭氏陽性菌尤其對(duì)常見的金黃色葡萄球菌和各種鏈球菌抗菌活性強(qiáng)，對(duì)革蘭氏陰性球菌和某些放線菌、螺旋體、阿米巴原蟲也有一定的抑制作用。鹽酸li多卡因?yàn)轷０奉惥植柯樽硭?，其作用機(jī)制為阻止神經(jīng)脈沖的發(fā)生、傳導(dǎo)與傳播。

duo粘菌素B和桿菌肽作為多肽類抗生素，通常采用液相色譜紫外檢測(cè)器法或微生物法測(cè)定。而硫酸新霉素的紫外吸收較弱，一般采用通用型檢測(cè)器進(jìn)行分析。鹽酸li多卡因則采用另一種液相色譜紫外方法進(jìn)行檢測(cè)。因此對(duì)于該復(fù)方制劑，可能需要2~3種液相色譜檢測(cè)法來分析其主要成分，其質(zhì)控流程較為繁瑣和耗時(shí)。也有研究采用HPLC-ELSD法來分析上述4種主要物質(zhì)，但該方法易受到復(fù)雜基質(zhì)的影響，靈敏度和重復(fù)性往往不能滿足檢測(cè)需求。

本應(yīng)用嘗試采用HPLC-CAD法對(duì)這4種主要成分同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)分析，考慮到這4種主要成分有的缺乏紫外生色團(tuán)，有的紫外吸收波長較低，易受干擾。但這4種主要成分通常不揮發(fā)，電霧式檢測(cè)器（CAD）非常適合作為主要的檢測(cè)手段。與蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）或示差折光檢測(cè)器（RI）相比，CAD可兼容梯度洗脫，具有更高的靈敏度，可降低復(fù)雜基質(zhì)的干擾。

duo粘菌素B結(jié)構(gòu)式：

硫酸新霉素結(jié)構(gòu)式：

桿菌肽結(jié)構(gòu)式：

鹽酸li多卡因結(jié)構(gòu)式：

2. 實(shí)驗(yàn)方法

2.1

儀器

Thermo Fisher Vanquish Core高效液相色譜儀，泵：Quaternary Pump C，自動(dòng)進(jìn)樣器：Split Sampler CT，柱溫箱：Column Compartment C，CAD檢測(cè)器：Vanquish CAD H。色譜軟件：變色龍Chromeleon 7.3

2.2

試劑

乙腈、甲酸、三氯yi酸（色譜級(jí)，F(xiàn)isher），去離子水（18.2 M?@25°C，Millipore純水機(jī)）。

2.3

儀器

硫酸duo粘菌素B、硫酸新霉素、桿菌肽和鹽酸li多卡因

2.4

樣品

市售復(fù)方duo粘菌素B軟膏

2.5

色譜條件

色譜柱：Phenyl 4.6mm×250mm，5 µm
柱溫：40°C
檢測(cè)器參數(shù)：蒸發(fā)溫度50℃，采集頻率5Hz，F(xiàn)ilter 3.6s，PFV 1.0
進(jìn)樣量：5µL
流動(dòng)相A：40mM三氯yi酸，B：甲醇， C：乙腈
梯度洗脫：參見表1
流速：1.0 mL/min

表1：梯度洗脫程序

3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 專屬性和線性范圍

分別取硫酸duo粘菌素B、硫酸新霉素、桿菌肽和鹽酸li多卡因適量，用水溶解并稀釋得到一系列不同濃度的混標(biāo)溶液，考察專屬性和線性情況。各單標(biāo)溶液及空白溶劑疊加色譜圖如圖1所示，結(jié)果表明該方法條件下各物質(zhì)分離效果、峰形及峰響應(yīng)均良好，空白溶液無干擾。

圖1：4種單標(biāo)及空白（黑色）疊加色譜圖

混標(biāo)溶液的典型色譜圖如圖2所示，取4~40ppm濃度范圍的混標(biāo)溶液分別進(jìn)樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2：混標(biāo)溶液典型色譜圖

圖3：各物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

結(jié)果顯示， 各物質(zhì)在其濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均≥ 0.997

表2：方法線性結(jié)果

3.2 靈敏度

將混標(biāo)溶液不斷稀釋并進(jìn)行檢測(cè)，通過信噪比（S/N）值來考察CAD檢測(cè)器對(duì)硫酸duo粘菌素B、硫酸新霉素、桿菌肽和鹽酸li多卡因的靈敏度。如圖4所示，當(dāng)混標(biāo)濃度為8ppm時(shí)，各物質(zhì)的S/N接近定量限要求；當(dāng)混標(biāo)濃度為4ppm時(shí)，各物質(zhì)的S/N接近檢測(cè)限要求,結(jié)果表明HPLC-CAD方法靈敏度較高。

圖4：各物質(zhì)的檢測(cè)限（LOQ）和定量限（LOD）

3.3 重復(fù)性

取濃度為20ppm的混標(biāo)溶液連續(xù)進(jìn)樣6針后計(jì)算各物質(zhì)峰面積的%RSD，來考察CAD檢測(cè)器的重復(fù)性，結(jié)果見表3、圖5。

表3：各物質(zhì)重復(fù)性結(jié)果

圖5：重復(fù)性結(jié)果色譜圖

3.4 樣品分析

取市售復(fù)方duo粘菌素B軟膏樣品適量，加水混勻，振蕩30分鐘后離心3分鐘，取上清液過微孔濾膜后直接進(jìn)樣分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明樣品中各物質(zhì)峰形，靈敏度及分離度等均符合分析要求（圖6）。

圖6：市售樣品色譜圖

4. 結(jié)論

本應(yīng)用建立一種HPLC-CAD法，可對(duì)復(fù)方duo粘菌素B軟膏中的硫酸duo粘菌素B、硫酸新霉素、桿菌肽和鹽酸li多卡因這4種主要成分同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)分析。該方法靈敏度較高，檢測(cè)限可低至4µg/mL；重復(fù)性好，連續(xù)6針峰面積%RSD均＜2.5%；基質(zhì)干擾小，市售產(chǎn)品中的各物質(zhì)峰基本不受基質(zhì)影響。本應(yīng)用方法方便、快捷，可有效提高檢測(cè)效率，縮短產(chǎn)品質(zhì)控流程。