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吳燕嬌 冉良驥

細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞和分子生物學(xué)所使用的一項(xiàng)重要技術(shù)，為細(xì)胞正常生理和生化研究（如代謝研究、衰老研究）、藥物和毒性化合物對(duì)細(xì)胞的作用、以及致突變性和致癌性研究提供了上佳的模型系統(tǒng)。細(xì)胞培養(yǎng)還可用于藥物篩選和開(kāi)發(fā)，以及生物化合物（如疫苗、治療性蛋白質(zhì)）的大規(guī)模生產(chǎn)。自從1955年Harry Eagle博士在《Science》雜志上發(fā)表研究文章并發(fā)布“一個(gè)包含無(wú)機(jī)鹽、糖、氨基酸、維生素及其他必須營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的等滲透壓且具有pH緩沖能力的混合物"細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方以來(lái)，眾多生物制藥團(tuán)隊(duì)對(duì)培養(yǎng)基的開(kāi)發(fā)與優(yōu)化從未停下腳步。2000年后，化學(xué)成分明確的細(xì)胞培養(yǎng)基，逐漸成為細(xì)胞培養(yǎng)基開(kāi)發(fā)的主流，用以支持高密度培養(yǎng)及高產(chǎn)物表達(dá)的研究。

以賽默飛Gibco™細(xì)胞培養(yǎng)基為例，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的工藝控制和污染檢測(cè)，其質(zhì)量、安全性、批間一致性和合規(guī)性均得到保證，可以滿足客戶從基礎(chǔ)研究到放大生產(chǎn)的特定細(xì)胞培養(yǎng)需求。

賽默飛Gibco細(xì)胞培養(yǎng)基系列產(chǎn)品

不同類型的培養(yǎng)細(xì)胞（點(diǎn)擊查看大圖）

通常培養(yǎng)基的成分和配比需要進(jìn)行針對(duì)性的調(diào)整，才能滿足不同培養(yǎng)底物的生長(zhǎng)需求。PaulJ.Price[1]在2017年發(fā)表的一篇文獻(xiàn)就詳細(xì)的描述了培養(yǎng)基的成分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。在本文中，我們嘗試結(jié)合Thermo Scientific™ Vanquish™ Duo液相色譜及Thermo Scientific™ CAD電霧式檢測(cè)器對(duì)培養(yǎng)基中各類基礎(chǔ)組分進(jìn)行了分析，可以作為培養(yǎng)基生產(chǎn)研發(fā)企業(yè)與生物醫(yī)藥研發(fā)企業(yè)的參考。

本方案分為四個(gè)液相方法。方法1測(cè)定培養(yǎng)基中的糖，方法2測(cè)定培養(yǎng)基中的核苷酸，方法3測(cè)定培養(yǎng)基中的氨基酸，方法4測(cè)定培養(yǎng)基中的維生素。大部分氨基酸紫外吸收較弱，通常需要經(jīng)過(guò)合適的衍生試劑經(jīng)衍生化反應(yīng)增加發(fā)色團(tuán)后，再使用UV檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。由于衍生化反應(yīng)操作比較繁瑣、以及對(duì)衍生化效率、氨基酸衍生物穩(wěn)定性方面的考慮，我們采用CAD電霧式檢測(cè)器對(duì)氨基酸進(jìn)行不衍生直接測(cè)定。CAD檢測(cè)器較傳統(tǒng)紫外檢測(cè)器、ELSD檢測(cè)器等有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，分析物既不需要發(fā)色團(tuán)也不需要離子化，適用于不揮發(fā)及半揮發(fā)化合物的高靈敏度檢測(cè)，可以實(shí)現(xiàn)糖與氨基酸高靈敏度檢出。培養(yǎng)基成分復(fù)雜，需要采用不同的檢測(cè)器分析不同的組分，在一定程度上可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)效率，賽默飛Vanquish Duo液相特有的雙泵、雙針自動(dòng)進(jìn)樣器，則可以實(shí)現(xiàn)一套儀器兩條流路(left、right system)獨(dú)立運(yùn)行，無(wú)污染無(wú)干擾且高效的進(jìn)行分析，有效解決分析痛點(diǎn)的同時(shí)，同時(shí)獲得事半功倍的效果。

Vanquish CAD示意圖

Vanquish Duo液相系統(tǒng)連接示意圖及并聯(lián)工作流程

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方法一：

每一個(gè)生長(zhǎng)培養(yǎng)基都需要碳源，以供細(xì)胞新陳代謝。碳源通常是葡萄糖，也可以是其他糖類，如半乳糖、己糖、蔗糖、果糖或其他碳源(如丙酮酸，谷氨酰胺)等。采用Vanquish液相系統(tǒng)及CAD電霧式檢測(cè)器測(cè)定培養(yǎng)基中葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖等組分。

乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖CAD測(cè)定圖譜

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方法二：

在低血清、無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基中，為滿足細(xì)胞生長(zhǎng)增殖需要，常常添加一些成份：蛋白質(zhì)、多肽、核苷、嘌呤、檸檬酸循環(huán)的中間產(chǎn)物、脂類、及一些血清替代因子等。隨著細(xì)胞的不斷分裂，DNA不斷復(fù)制，細(xì)胞內(nèi)部原有的的核苷酸不足以保證DNA的順利完成復(fù)制時(shí)，就必須要從培養(yǎng)基中攝取核苷酸供細(xì)胞的DNA復(fù)制需要。采用Vanquish Duo HPLC系統(tǒng)，Hypercarb石墨化碳色譜柱，UV檢測(cè)器測(cè)定5種核苷酸。

五種核苷酸測(cè)定圖譜

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方法三：

所有的培養(yǎng)基配方含有10種必需氨基酸以及半胱氨酸、谷氨酰胺和酪氨酸。在一些培養(yǎng)基中還需要加入其他非必需氨基酸(丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸和絲氨酸)，可以減少細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān)，從而達(dá)到細(xì)胞增殖的目的。采用CAD電霧式檢測(cè)器與Hypercarb石墨化碳色譜柱無(wú)需衍生直接測(cè)定培養(yǎng)基中20種氨基酸。

氨基酸無(wú)需衍生電霧式檢測(cè)器直接測(cè)定培養(yǎng)基中20種氨基酸譜圖（點(diǎn)擊查看大圖）

氨基酸測(cè)定線性圖譜

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方法四：

維生素是維持細(xì)胞生長(zhǎng)的生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞代謝中起調(diào)節(jié)及控制作用。水溶性維生素主要包括泛酸、維生素B12、葉酸、煙酰胺、吡哆醛、硫胺素、核黃素、維生素C、膽堿、肌醇等。賽默飛Vanquish液相結(jié)合紫外檢測(cè)器，可以有效檢測(cè)培養(yǎng)基中水溶性維生素。

水溶性維生素測(cè)定圖譜

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結(jié)論：

Vanquish Duo搭配紫外、CAD等檢測(cè)器，可以高效、靈活地解決培養(yǎng)基中各類基礎(chǔ)組分分析的難題。與質(zhì)譜方案相比， Vanquish Duo液相結(jié)合CAD檢測(cè)器的并聯(lián)分析方案能有有效降低儀器配置成本，人員操作難度，更適合在QC實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行推廣。

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參考文獻(xiàn)：

[1]. Price, P. J. (2017). Best practices for media selection for mammalian cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal, 53(8), 673–681. doi:10.1007/s11626-017-0186-6

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