原創(chuàng) 飛飛 賽默飛色譜與質譜中國
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崔宇 冉良驥
今天與大家分享一篇由中國食品藥品檢定研究院（NIFDC）與賽默飛世爾科技（中國）有限公司共同發(fā)表于Vaccines的文章，主要內容為基于電霧式檢測器（CAD）完成了對于新型冠狀病毒mRNA疫苗中脂質體方法學的建立及驗證，并完成了mRNA疫苗中脂質體含量的測定，對于控制mRNA疫苗的安全性和有效性具有重要意義。
01
背景介紹
2023年6月15日，比爾?蓋茨在全球健康藥物研發(fā)中心舉辦的特別活動中表示， mRNA疫苗技術使預防結核病和瘧疾等疾病的疫苗成為可能。與傳統(tǒng)滅活或減毒病毒疫苗、基因工程重組疫苗和基于病毒載體的疫苗等疫苗平臺相比，mRNA疫苗具有安全性高、表達瞬間、體液免疫和細胞免疫雙重機制、生產工藝簡單、生產效率高、成本低等特點。因此，它們在處理大規(guī)模和新出現(xiàn)的流行病方面具有突出的優(yōu)勢。然而，mRNA疫苗也存在不穩(wěn)定、免疫原性高、遞送效率低等缺點。定制遞送系統(tǒng)的開發(fā)可以進一步提高mRNA疫苗的穩(wěn)定性和轉染能力。脂質納米顆粒是目前這些mRNA疫苗應用最廣泛的遞送系統(tǒng)。
一種用于COVID-19 mRNA疫苗遞送的LNPs系統(tǒng)(如下圖1所示)，使用以下四種類型的脂質體：具有胺官能團的陽離子脂質 (9001)，脂質-聚乙二醇2K偶聯(lián)物(DMG-PEG2K)，膽固醇(CHOLE)和兩性離子輔助磷脂(DSPC)。脂質體在儲存和運輸過程中容易聚集和降解，影響了COVID-19 mRNA疫苗的效率和安全性。因此，脂質體的含量對確保COVID-19 mRNA疫苗的質量至關重要，需要在生產和放行階段嚴格控制。本文建立了一種高效的高效液相色譜-電霧式檢測器(HPLC-CAD)方法，用于LNPs包封的COVID-19 mRNA疫苗的脂質體分析，并對該方法進行了全面的方法學驗證。
圖1. LNP遞送系統(tǒng)
（點擊查看大圖）
02
材料及方法
儀器配置：
Thermo Scientific™ UltiMate™ 3000 液相色譜儀、Thermo Scientific™ Corona™ Veo™ RS CAD檢測器
色譜條件：
C18色譜柱；流動相A：0.01M 乙酸三乙胺水溶液，流動相B：0.01M 乙酸三乙胺甲醇；流速為1.0 mL/min；柱溫為55℃；進樣體積：10μL
梯度洗脫條件見下表：
電霧式檢測器：采集頻率10Hz；蒸發(fā)溫度50℃，濾波3.6s
03
結果與討論
專屬性實驗結果
對比混標溶液、專屬性溶液（不含脂質體的mRNA的空白）和純甲醇色譜圖結果可見，脂質體出峰位置沒有其他干擾峰的存在。
圖2. 50%濃度混標溶液(a)、專屬性溶液(b)和純甲醇(c)色譜圖（點擊查看大圖）
準確性實驗結果
分別對PEG2K-DMG、CHOLE、DSPC和9001進行混合添加回收率測定，添加濃度分別為50%、75%、100%、125%、150%、200%，各3個平行，兩個驗證實驗室共重復6天。結果表明，所有添加樣品中的四個脂質體的回收率均在90%~110%之間。表明該方法準確性良好。
圖3. 兩個驗證實驗室不同添加濃度(50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 200%)回收率（點擊查看大圖）
線性實驗結果
分別配制PEG2K-DMG、CHOLE、DSPC和9001的濃度為50%、75%、100%、125%、150%、200%的標準溶液，測定得到二次線性曲線，所有標準曲線的相關系數(shù)均大于0.99。
表1. 脂質體標準曲線
（點擊查看大圖）
樣品測定結果
使用上述方法，使用流動相B對COVID-19 mRNA 疫苗樣品稀釋20倍后直接測定，樣品中脂質體測定值與理論值接近，結果見下圖所示。
圖 4. 樣品及空白溶液色譜圖結果
（點擊查看大圖）
04
結論
本文建立了CAD檢測器測定mRNA疫苗中脂質體含量的方法，并完成了整套的方法學驗證及對實際疫苗樣品的測定，結果均表明此方法是可靠的、準確的、無干擾的，適用于mRNA類疫苗中脂質體的安全性和有效性質控。
從CAD檢測器進入2020版中國藥典的數(shù)多年，到今年4月30日美國藥典USP發(fā)布的“Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality"2.0草案中明確寫明脂質表征和含量測定使用CAD檢測器。CAD檢測器得到了越來越多國內及國外客戶的認可及使用，協(xié)助客戶完成產品的研發(fā)至質控工作。
參考文獻：
[1] Validation of an HPLC-CAD Method for Determination of Lipid Content in LNP-Encapsulated COVID-19 mRNA Vaccines. Vaccines. 2023,11, 937. https://doi.org/10.3390 /vaccines11050937.
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