一、實驗原理
凝膠層析又稱排阻層析、分子篩層析和凝膠過濾。凝膠是由膠體溶液凝結(jié)而成的固體物質(zhì)，其內(nèi)部具有很細(xì)微的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠層析的機理是分子篩效應(yīng)。凝膠顆粒在合適溶劑中浸泡，充分吸液膨脹，然后裝入層析柱內(nèi)，加入欲分離的混合物后，再以同一溶劑洗脫。在洗脫過程中大分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部而沿凝膠顆粒間的空隙先流出柱外，而小分子可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，流速緩慢，以致后流出柱外，從而使樣品中分子大小不同的物質(zhì)按順序分離開。
目前使用的凝膠有葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠和瓊脂糖與葡聚糖組成的復(fù)合凝膠。本實驗用的是葡聚糖凝膠，是由多聚葡萄糖與環(huán)氧化氯丙烷通過交聯(lián)反應(yīng)制成的有孔顆粒狀凝膠。
根據(jù)凝膠層析的原理，對同一類型化合物，其洗脫特征與組分的相對分子質(zhì)量有關(guān)，流過凝膠柱時，按分子大小順序流出，相對分子質(zhì)量大者走在前面。通常以對相對分子質(zhì)量的對數(shù)作圖可得一曲線，稱“選擇曲線”，曲線斜率是凝膠性質(zhì)的一個重要特征，在一定范圍內(nèi)，曲線愈陡分級愈好。在測定末知物的相對分子質(zhì)量時，以使用曲線的直線部分為宜。
二、實驗用品
（一）器材
（1）層析柱：1.1×100cm。
（2）核酸蛋白質(zhì)檢測儀或紫外分光光度計。
（3）自動部分收集器，恒壓瓶，口瓶。
（二）試劑
（1）Sephadex G-75。
（2）5% Ba(AC)2。
（3)洗脫液：0.025mol/L Kcl０.２ｍｏｌ／Ｌ 乙酸溶液。
（4）藍(lán)色葡聚糖－２０００（２mｇ／ｍｌ）。
（5）Ｎ－乙酰酪氨乙酯（１～２ｍｇ／ｍｌ）。
（6）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合液（各２～３mg／ｍｌ，用Kcl－乙酸溶液配制）；包括牛血清白蛋白，雞卵清蛋白，胰凝乳蛋白酶原和結(jié)晶牛胰島素，均需層析純。
（三）材料
牛血清白蛋白，雞卵清蛋白，胰凝乳蛋白原A，結(jié)晶牛胰島素，以上材料均需層析純。
三、實驗程序
（一）操作方法
1.一般操作方法
（１）凝膠的選擇和處理：凝膠顆粒大小均勻。對于顆粒不均勻的凝膠，可將其懸浮于大體積的水中，讓其自然沉降，在一定時間之后，用傾瀉法除去懸浮的過細(xì)顆粒。
將稱好的凝膠干粉傾入過量的洗脫液中，室溫下放置，使之充分溶脹。注意不要過分?jǐn)嚢瑁苑李w粒破碎。溶脹時間因凝膠交聯(lián)度不同而異。為了縮短溶脹時間，殺死細(xì)菌和霉菌，排除凝膠內(nèi)氣泡，可在沸水浴上加熱。
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