在制藥行業(yè)中，通常使用分析儀器來評估某種產(chǎn)品是否符合要求的規(guī)范，以保證質(zhì)量和安全性。在美國藥典中，通用章節(jié)<1058>USP介紹了分析儀器確認(rèn)(AIQ)的準(zhǔn)則，以確保所有儀器都能產(chǎn)生可靠且一致的數(shù)據(jù)。AIQ過程涉及在儀器使用壽命內(nèi)相互關(guān)聯(lián)的活動，以確定其目的的適用性。這些活動可分為以下四類(見圖1):
設(shè)計(jì)確認(rèn)包括儀器所需的功能和操作規(guī)范以及儀器預(yù)期用途的適用性。
安裝確認(rèn)確保儀器和軟件按照設(shè)計(jì)和規(guī)定進(jìn)行安裝和配置。所有活動均有文件記錄。
操作確認(rèn)用于確認(rèn)儀器是否按預(yù)期運(yùn)行。還測試了包括安全數(shù)據(jù)存儲、備份和歸檔在內(nèi)的軟件功能。所有活動均有文件記錄。
性能確認(rèn)控制儀器在現(xiàn)實(shí)世界使用條件下按規(guī)定執(zhí)行。
在本文中，對珀金埃爾默Lambda 365+紫外/可見分光光度計(jì)進(jìn)行了操作確認(rèn)。
圖1.分析儀器確認(rèn)過程
1 操作確認(rèn)
紫外/可見分光光度計(jì)是一種用途廣泛的儀器，在制藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。當(dāng)在規(guī)定的環(huán)境中操作時(shí)，紫外/可見分光光度計(jì)(如應(yīng)用的任何其他儀器)需要經(jīng)過確認(rèn)性驗(yàn)證，并保證分析結(jié)果可靠且一致，從而滿足質(zhì)量要求。在國際藥典的特定章節(jié)中列出了相關(guān)指南，包括《美國藥典》(USP<857>)和《歐洲藥典》(EP 2.2.25)，其中詳細(xì)說明了驗(yàn)證紫外/可見分光光度計(jì)性能的程序。雖然2019年對EP 2.2.25進(jìn)行了修訂，但USP<857>的最新版本是2022年12月發(fā)布的。
在這些指南中，要求對紫外/可見分光光度計(jì)的性能進(jìn)行驗(yàn)證，以確認(rèn)以下參數(shù)符合規(guī)定要求:
強(qiáng)烈建議使用國家和國際監(jiān)管機(jī)構(gòu)或認(rèn)證機(jī)構(gòu)認(rèn)可的認(rèn)證參考物質(zhì)(CRM)進(jìn)行測試，而不是使用更容易出錯(cuò)的自制標(biāo)準(zhǔn)品。
在本文中，根據(jù)USP<857>和EP 2.2.5在LAMBDA 365+紫外/可見分光光度計(jì)上進(jìn)行測試(LAMBDA 365+Touch也可以獲得類似結(jié)果)。作為通用操作確認(rèn)(UOQ)方案的一部分，使用珀金埃爾默One Source服務(wù)提供的安全加密報(bào)告系統(tǒng)顯示每次測試的結(jié)果。UOQ方案還包括日本藥典合規(guī)性，因?yàn)長AMBDA 365+也可以完全符合日本藥典標(biāo)準(zhǔn)。該報(bào)告涵蓋符合ASTM-E-291和FDA MAN-0000482的通過/不通過結(jié)果和內(nèi)置計(jì)算，使用數(shù)字證書技術(shù)防止復(fù)制和篡改，同時(shí)符合21CFR第11部分標(biāo)準(zhǔn)。
2 波長控制
LAMBDA 365+紫外/可見光分光光度計(jì)是一種基于單色器的分光光度計(jì)，通過電機(jī)驅(qū)動移動反光鏡和光柵來實(shí)現(xiàn)波長的選擇。這種選擇的準(zhǔn)確度至關(guān)重要，并且當(dāng)測量表現(xiàn)出窄吸收峰的樣品時(shí)變得更加重要。可以使用以下一個(gè)或多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品來控制波長光譜的紫外和可見光區(qū)的波長準(zhǔn)確度:
在本文中，使用高氯酸溶液中的氧化鈰、高氯酸溶液中的氧化鈥和釹鐠玻璃濾光片來覆蓋紫外和可見光區(qū)。對于每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，收集六個(gè)吸收光譜來評估觀察到的峰的準(zhǔn)確度。使用UV WinLab軟件中直接創(chuàng)建的簡單處理方程提取峰值波長。在圖3、圖4和圖5中，報(bào)告了為每個(gè)CRM收集的六個(gè)吸收光譜中的一個(gè)。圖6的報(bào)告中報(bào)告了不同峰值獲得的波長，以及從六個(gè)光譜中獲得的平均值與認(rèn)證波長值之差(“Diff mean與Cert”)，以評估準(zhǔn)確度。根據(jù)要求，在USP<857>(報(bào)告左側(cè)部分)的情況下，測量精確度也被指定為標(biāo)準(zhǔn)偏差(“SD”)及其四舍五入值。所有結(jié)果均大大優(yōu)于兩部藥典設(shè)定的限值，測試證實(shí)了Lambda 365+紫外/可見分光光度計(jì)的波長準(zhǔn)確度。
表1.用于波長控制的儀器參數(shù)--氧化鈰溶液、氧化鈥溶液、釹鐠玻璃
圖3.用于波長準(zhǔn)確度控制的高氯酸中氧化鈰的吸收光譜(為本標(biāo)準(zhǔn)品收集的六個(gè)光譜之一)
圖4.用于波長準(zhǔn)確度控制的高氯酸中4%氧化鈥溶液的吸收光譜(為本標(biāo)準(zhǔn)品收集的六個(gè)光譜之一)
圖5.用于波長準(zhǔn)確度控制的釹鐠玻璃的吸收光譜(為本標(biāo)準(zhǔn)品收集的六個(gè)光譜之一)用于波長控制的吸收峰位于681.02nm和875.74nm處
圖6.使用氧化鈰溶液、氧化鈥溶液和釹鐠玻璃控制紫外線、可見光和擴(kuò)展可見光區(qū)(左側(cè)為USP<857>，右側(cè)為EP 2.2.25)波長的結(jié)果（點(diǎn)擊查看大圖）
3吸光度控制
紫外-可見分光光度計(jì)光度響應(yīng)的評估是確保讀數(shù)準(zhǔn)確無誤的基礎(chǔ)。當(dāng)按照朗伯-比爾定律進(jìn)行定量分析以確定分析物濃度時(shí)，這變得更加重要。吸光度控制程序要求測量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在特定波長下的吸收值，以覆蓋預(yù)期的應(yīng)用光譜范圍，以及至少兩個(gè)吸光度水平范圍。將獲得的值與所用CRM的報(bào)告值進(jìn)行比較，并檢查準(zhǔn)確度和精確度是否低于規(guī)定限值(見圖7)。
可使用的標(biāo)準(zhǔn)品如下:
在本文中，使用重鉻酸鉀(60mg/L和160mg/L)和三個(gè)中性密度玻璃濾光片。對于每個(gè)波長，收集六個(gè)重復(fù)樣品，并計(jì)算相應(yīng)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，如圖7和圖8所示。所有測試均順利通過，認(rèn)證吸收率和實(shí)測吸收率之間的差異甚至比藥典標(biāo)準(zhǔn)要求的限值高出一個(gè)數(shù)量級。
表2.用于控制吸光度的儀器參數(shù)--重鉻酸鉀溶液
圖7.吸光度控制值--重鉻酸鉀溶液（點(diǎn)擊查看大圖）
圖8.吸光度控制值--中性密度玻璃濾光片（點(diǎn)擊查看大圖）
4 吸光度線性
吸光度線性測試是吸光度控制的擴(kuò)展，其中在預(yù)期光譜范圍內(nèi)測試光度響應(yīng)的線性。推薦用于控制吸光度的CRM和相同的儀器設(shè)置參數(shù)(見表3)也可用于控制紫外線和可見光區(qū)的吸光度線性?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)規(guī)定，判定系數(shù)(R2)必須大于0.999。將吸光度測試控制過程中獲得的吸光度值與認(rèn)證的吸光度值進(jìn)行繪圖，以計(jì)算R2，R2為1.000，證實(shí)吸光度線性(見圖9)。最新版本的USP<857>不再需要此測試。
表3.用于控制吸光度的儀器參數(shù)--中性密度玻璃濾光片
圖9.吸光度線性測試的結(jié)果吸光度值是從吸光度控制測試中獲得的（點(diǎn)擊查看大圖）
5 雜散光限值
雜散光是指到達(dá)探測器的所有不需要的輻射，即使這種輻射不是根據(jù)所選波長的帶寬選擇的。雜散光主要是由色散元件中的缺陷引起的，例如單色器的光柵組件、衍射效應(yīng)或損壞/磨損的組件。這導(dǎo)致了與朗伯-比爾定律的負(fù)偏差，并設(shè)置了儀器可能的最大吸光度值的上限。雜散光對于高濃度樣品來說更為重要，因?yàn)殡s散光成分可能代表到達(dá)探測器的輻射的最大部分。截止濾光液用于確定雜散光限值。這些溶液吸收低于特定波長的光，同時(shí)透射更高波長的光?？梢酝ㄟ^測量低于這種截止波長的吸光度來獲得雜散光，其中任何透射的光都是由雜散光提供的。推薦的CRM截止濾光液如下:
在本文中，使用了上述所有CRM標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)USP<857>，有兩種程序可用于控制雜散光。程序A要求使用5 mm比色皿收集截止標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，并從使用10 mm比色皿中的相同截止標(biāo)準(zhǔn)溶液獲得的吸光度中減去所得值。程序B要求測量裝滿截止濾光液的10mm比色皿相對于裝滿適當(dāng)參比溶液的10mm比色皿的吸光度。在本研究中，遵循了與EP.2.2.25中所述相同的程序B(儀器參數(shù)見表4)。為所有CRM收集的所得吸光度值高于可接受限值(吸光度值等于10表示儀器飽和)，確認(rèn)儀器通過雜散光控制極限(見圖10)。
表4.用于雜散光限值的儀器參數(shù)
圖10.雜散光限值測試結(jié)果吸光度值等于10表明儀器已飽和（點(diǎn)擊查看大圖）
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6 光譜分辨率
分光光度計(jì)的光譜分辨率是指其將兩個(gè)相鄰峰分解為單獨(dú)峰的能力。分辨率與分光光度計(jì)的狹縫和用于收集光譜的數(shù)據(jù)點(diǎn)間隔有關(guān)。SBW(光譜帶寬)定義為在來自單色器的光帶最大強(qiáng)度的一半處測量的寬度，其與儀器的物理狹縫有關(guān)。通過在分光光度計(jì)中設(shè)置較低的狹縫值來選擇較低的SBW將保證分辨率更佳，盡管這可能會導(dǎo)致噪聲更大(穿過樣品的光會更少)。通常，建議將狹縫設(shè)置在分析物吸收帶FWHM(半峰全寬)的1/8左右。用于確定分光光度計(jì)光譜分辨率的CRM標(biāo)準(zhǔn)品如下:
通過測量在269 nm處收集到的最大吸收值和在266 nm處收集到的最小吸收值之比來確定光譜分辨率(已烷中甲苯的吸收光譜見圖11)。用于光譜分辨率測試的儀器設(shè)置參數(shù)如表5所示。266 nm和269 nm處的吸收值是使用處理方程獲得的，該處理方程從光譜中提取吸收值，然后減去在300 nm處獲得的基線?？梢院苋菀椎刂苯釉赨V WinLab軟件中創(chuàng)建處理方程。發(fā)現(xiàn)該比率等于2，并且由于驗(yàn)收限值為A269/A266>1.3，測試順利通過(見圖12)。
表5.光譜分辨率測試的儀器參數(shù)
圖11.已烷 (0.020% v/v)溶液中甲苯的吸收光譜(用于光譜分辨率測試)（點(diǎn)擊查看大圖）
圖12. 光譜分辨率測試的結(jié)果（點(diǎn)擊查看大圖）
結(jié)論
珀金埃爾默LAMBDA 365+紫外/可見分光光度計(jì)不僅符合，而且超過了全球藥典標(biāo)準(zhǔn)USP<857>和EP 2.2.25(該儀器也符合日本藥典標(biāo)準(zhǔn))指南規(guī)定的要求。所有對照測試均順利通過，證實(shí)Lambda 365+將提供可靠的結(jié)果并確保高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。使用超安全報(bào)告顯示每次測試的結(jié)果，該報(bào)告是珀金埃爾默One Source服務(wù)執(zhí)行的UOQ(通用操作確認(rèn))的一部分。
本文件使用數(shù)字證書技術(shù)提供安全的加密報(bào)告，以防止修改、刪除或復(fù)制，從而符合21 CFR第11部分標(biāo)準(zhǔn)。控制LAMBDA 365+紫外/可見分光光度計(jì)的UV WinLab增強(qiáng)安全(ES)軟件也完全符合21 CFR第11部分的規(guī)定，為制藥行業(yè)的實(shí)驗(yàn)室提供了信任其結(jié)果和依賴其數(shù)據(jù)完整性的最佳解決方案。
參考文獻(xiàn)
1.ASTM-E-29:“Standard Practice for Using Significant Digits in Test Data to Determine Conformance with Specifications”.
2.FDA MAN-000048:“ORA Lab Manual Vol. lll Section 4-Basic Statistics and Data Presentation”.
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