試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被可溶性細(xì)胞間粘附分子1（sICAM-1）抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的可溶性細(xì)胞間粘附分子1（sICAM-1）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品濃度。

樣品收集、處理及保存方法:

1.血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2.血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。

3.細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。

4.組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。

5.保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品:

1.37℃恒溫箱

2.酶標(biāo)儀（450nm）

3.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

操作注意事項(xiàng):

1.所有液體組分使用前充分搖勻。

2.嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。

3.試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20 分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶，這屬于正常現(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。

4.濃度為0 的S0 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品即可視為陰性對(duì)照或者空白；按照說明書操作時(shí)樣本已經(jīng)稀釋5 倍，zui終結(jié)果乘以5 才是樣本實(shí)際濃度。

5.實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

試劑盒組成:

名稱96孔配置48孔配置備注;

微孔酶標(biāo)板12 孔×8 條12 孔×4 條無;

標(biāo)準(zhǔn)品0.3mL*6 管0.3mL*6 管無;

樣本稀釋液6mL 3mL 無;

檢測(cè)抗體-HRP 10mL 5mL 無;

20×洗滌緩沖液25mL 15mL 按說明書進(jìn)行稀釋;

底物A 6mL 3mL 無;

底物B 6mL 3mL 無;

終止液6mL 3mL 無;

封板膜2 張2 張無;

說明書1 份1 份無;

自封袋1 個(gè)1 個(gè)無;

注：標(biāo)準(zhǔn)品（S0-S5）濃度依次為：0、25、50、100、200、400 ng/mL.

試劑的準(zhǔn)備:20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20 稀釋，即1 份的20×洗滌緩沖液加19 份的蒸餾水。

洗板方法:

1.手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min 后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5 次。

2.自動(dòng)洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5 次。

操作步驟:

1.從室溫平衡20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；

3.樣本孔先加待測(cè)樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5 次（也可用洗板機(jī)洗板）。

6.每孔加入底物A、B 各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入終止液50μL，15min 內(nèi)，在450nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD 值。

結(jié)果判斷:繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel 工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD 值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。

試劑盒性能:

1.重復(fù)性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。

2.特異性:不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

3.準(zhǔn)確性:標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R 值，大于等于0.9900。

4.靈敏度:zui低檢測(cè)濃度小于1.0 ng/mL。

5.貯藏:2-8℃，避光防潮保存。

6.有效期:6個(gè)月

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人可溶性細(xì)胞間粘附分子1（sICAM-1）ELISA試劑盒說明書

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